Toll樣受體4激動(dòng)劑LPS腹腔注射對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的預(yù)防作用及其作用機(jī)制

班努·庫(kù)肯，嚴(yán)金龍，王敏敏，趙海燕，徐長(zhǎng)生，徐霞，楊夢(mèng)智

1 新疆醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院心內(nèi)科，烏魯木齊 830001；2 新疆醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院醫(yī)務(wù)部

冠心病是冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄、阻塞，造成心肌缺血缺氧或壞死導(dǎo)致的心臟病，是導(dǎo)致患者死亡的常見(jiàn)原因之一［1］。通過(guò)抗溶栓藥物或機(jī)械干預(yù)適當(dāng)或及時(shí)地恢復(fù)血流是心肌缺血的主要治療方法［2］。然而，通過(guò)干預(yù)去除阻塞使血流恢復(fù)通暢過(guò)程中，可能會(huì)誘發(fā)先前缺血部分心肌出現(xiàn)繼發(fā)性損傷，稱(chēng)為心肌缺血再灌注損傷（MIRI）［3］。多種機(jī)制如炎癥、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、新陳代謝改變等［4-5］參與MIRI，目前尚無(wú)特效治療方法。Toll 樣受體（TLR）是參與先天免疫的一類(lèi)蛋白質(zhì)分子，存在于人體各種免疫細(xì)胞中，能夠識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)病原物，從而誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。TLR4作為T(mén)LR家族成員之一，能夠結(jié)合革蘭陰性菌細(xì)胞壁中的脂多糖（LPS），從而活化炎性細(xì)胞并釋放炎性因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［6］。在特定情況下，TLR4能夠發(fā)揮心肌保護(hù)作用。有研究［7］發(fā)現(xiàn)，使用TLR4 受體激動(dòng)劑LPS 小劑量預(yù)處理能夠促進(jìn)MIRI 后心臟功能恢復(fù)，減少心肌梗死面積，但作用機(jī)制尚不明確。轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白O3a（FoxO3a）是一種高度進(jìn)化保守的轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)許多細(xì)胞過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞代謝等。SAMUEL 等［8］研究結(jié)果顯示，紅景天苷能夠抑制FoxO3a 的活化，從而減少心肌梗死面積，減輕心肌細(xì)胞凋亡，改善心臟功能，證實(shí)FoxO3a的活化與心肌梗死細(xì)胞持續(xù)凋亡相關(guān)。在組織細(xì)胞處于缺血缺氧的應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，F(xiàn)oxO3a 能夠調(diào)控細(xì)胞自噬而發(fā)揮重要作用［9］。FoxO3a 通常位于細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)磷酸化等修飾后，能夠從細(xì)胞質(zhì)定位到細(xì)胞核，作為信號(hào)途徑參與細(xì)胞自噬的過(guò)程［10］。因此我們猜測(cè)，F(xiàn)oxO3a 可能在LPS 預(yù)處理抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬從而減輕IRI 中發(fā)揮重要作用。2021年6月—2022年3月，我們觀察了LPS腹腔注射后進(jìn)行缺血再灌注處理的大鼠心功能、組織病理、心肌梗死面積，心肌組織FoxO3a 通路蛋白、自噬相關(guān)蛋白（Beclin-1、LC）的變化，以明確LPS 對(duì)于大鼠MIRI 是否有預(yù)防作用以及其作用機(jī)制，以期為臨床上MIRI治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑、儀器 60 只雄性SD 大鼠，8～10 周齡，體質(zhì)量200～250 g，晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食、飲水，購(gòu)自杭州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（生產(chǎn)許可證號(hào)碼：SCXK（浙）2019-0002）。實(shí)驗(yàn)于杭州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行（SYXK（浙）2019-0011），室溫（22 ± 2）℃，相對(duì)濕度60%～80%。主要試劑：鹽酸維拉帕米注射液（上海禾豐制藥有限公司）；LPS（sigma）；TTC染色液（索萊寶）；兔抗FoxO3a多克隆抗體、兔抗FoxO3a（phospho-ser253）多克隆抗體、兔抗Beclin 多克隆抗體、兔抗LC3B 多克隆抗體（博奧森公司）；鼠抗β-actin 單克隆抗體（義翹神州）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（英國(guó)Abcam公司）；HE染色試劑（索萊寶公司）；BCA蛋白濃度定量試劑盒（全式金廠）；RIPA 裂解液（武漢博士德生物工程公司）；SDS-PAGE 凝膠（Sangon Bio?tech公司）；PVDF膜（Millipore）；水合氯醛（上海源葉生物科技公司）。儀器：電子天平（上海菁海儀器有限公司，型號(hào)DY15K）；精密電子天平（上海菁海儀器有限公司，型號(hào)FA2004N）；臺(tái)式低速離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器有限公司，型號(hào)SF-TDL-5C）；恒溫水浴鍋（恒溫水浴鍋，型號(hào)DK-80）；小動(dòng)物人工呼吸機(jī)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司，型號(hào)ZS-MV-HXB）；MadLab 生物信息化醫(yī)學(xué)信號(hào)采集處理系統(tǒng)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司）；液氮罐（成都金鳳儀器廠）；-20 ℃低溫冰箱（合肥美菱公司）；-80 ℃低溫冰箱（合肥美菱公司）。

1.2 大鼠分組、LPS 腹腔注射、缺血再灌注處理將60 只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為L(zhǎng)PS 干預(yù)組（0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg）、維拉帕米干預(yù)組、模型組、假手術(shù)組，每組15 只。構(gòu)建MIRI 模型前7 d，LPS 干預(yù)組于給予不同的小劑量LPS（0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg）腹腔注射，維拉帕米干預(yù)組給予2.5%維拉帕米（2 mg/kg）腹腔注射，假手術(shù)組與模型組給予等容量生理鹽水腹腔注射；均每日1次。然后，除假手術(shù)組外，其余組大鼠進(jìn)行缺血再灌注處理。

缺血再灌注處理步驟：大鼠缺血再灌注前禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后固定于解剖臺(tái)，四肢連接心電圖機(jī)，然后解剖暴露心臟，采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支［9］的方法進(jìn)行缺血再灌注處理。用7-0絲線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈30 min致心肌缺血變白，心電圖可見(jiàn)ST段升高；接著松解結(jié)扎部位，恢復(fù)血流，心電圖顯示ST段回落，心肌由白變紅，隨后關(guān)閉胸腔。

1.3 大鼠心功能指標(biāo)檢測(cè) 大鼠經(jīng)過(guò)上述處理后72 h，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉，采用IE33 彩色多普勒超聲診斷儀觀察各組大鼠各腔室大小及室壁運(yùn)動(dòng)情況。心臟功能測(cè)定軟件計(jì)算大鼠左心室收縮末壁厚度（LVPWs）、左心室舒張末壁厚度（LVPWd）、左心室收縮末內(nèi)徑（LVIDs）、左心室舒張末內(nèi)徑（LVIDd）、左心室收縮末容積（LVESV）、左心室舒張末容積（LVEDV）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、短軸縮短率（LVFS），連續(xù)測(cè)量3 個(gè)心動(dòng)周期后計(jì)算平均值。

1.4 大鼠心肌組織病理學(xué)變化觀察、梗死面積測(cè)算 心肌組織病理學(xué)變化觀察：采用HE 染色法。按試劑盒步驟操作后，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織病理變化并采集圖像。

心肌梗死面積測(cè)算：采用TTC 染色法。各組大鼠心臟組織置于－80 ℃冰箱冷凍后，將組織沿橫斷面切成4～5片，用1% TTC避光復(fù)染15 min，4%多聚甲醛溶液固定后拍照。紅色區(qū)域?yàn)樾募》枪Ｋ绤^(qū)，白色區(qū)域?yàn)樾募」Ｋ绤^(qū)域，AlphaEaseFC處理軟件分析各組大鼠心肌梗死面積及心肌總面積，計(jì)算心肌梗死面積面積百分比（心肌梗死面積/心肌總面積）。

1.5 大鼠心肌組織中FoxO3a、pFoxO3aS253、Beclin-1、LC3 的檢測(cè) 采用Western blotting 法。將凍存的心肌組織剪碎，移入預(yù)先加好RIPA裂解液的離心管中，超聲波破碎研磨，冰上裂解30 min 以提取總蛋白，BCA 法定量，然后按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，凝膠成像顯影儀成像并獲得蛋白條帶，以β-actin 蛋白作內(nèi)參，Image-Pro Plus 軟件分析條帶灰度值，目的蛋白與β-actin 蛋白的灰度值之比表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較 各組大鼠心功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVEF、LVFS 減小（F分別為6.410、5.921，P均＜0.05）；與模型組比較，維拉帕米干預(yù)組和LPS干預(yù)組大鼠LVEF、LVFS 增加（F分別為6.410、5.921，P均＜0.05）。

表1 各組大鼠心功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（± s）

表1 各組大鼠心功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（± s）

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2.2 各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化、心肌梗死面積比較 假手術(shù)組大鼠心肌纖維排列整齊，心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，可見(jiàn)橫紋，未見(jiàn)明顯異常；模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，斷裂嚴(yán)重，可見(jiàn)較多出血灶，心肌細(xì)胞水腫嚴(yán)重，部分溶解、壞死或核固縮，間質(zhì)可見(jiàn)較多炎性細(xì)胞散在或灶狀浸潤(rùn)；與模型組比較，0.1 mg/kg LPS干預(yù)組及0.5 mg/kg LPS干預(yù)組大鼠心肌病變改善不明顯，維拉帕米干預(yù)組及1 mg/kg LPS干預(yù)組大鼠心肌纖維斷裂、心肌細(xì)胞壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度均明顯減輕。

0.1 mg/kg LPS 干預(yù)組、0.5 mg/kg LPS 干預(yù)組、1 mg/kg LPS干預(yù)組、維拉帕米干預(yù)組、模型組、假手術(shù)組心肌梗死面積百分比分別為26.60% ± 0.98%、23.04% ± 1.48%、12.87% ± 4.45%、12.51% ±1.23%、35.02% ± 2.81%、0.00% ± 0.00%。 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌梗死面積百分比升高（F=85.432，P＜0.05）；與模型組比較，維拉帕米干預(yù)組及LPS干預(yù)組的大鼠心肌梗死面積百分比均降低（F=85.432，P＜0.05）。

2.3 各組大鼠心肌組織FoxO3a、pFoxO3aS253、Beclin1、LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 各組大鼠心肌組織FoxO3a、pFoxO3aS253、Beclin1、LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中FoxO3a 蛋白相對(duì)表達(dá)量未發(fā)生變化（F為6.410，P＞0.05）；與模型組比較，維拉帕米干預(yù)組及LPS 干預(yù)組的大鼠心肌組織中FoxO3a蛋白相對(duì)表達(dá)量也均未發(fā)生變化（F為6.410，P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組pFoxO3aS253蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào)（F為11.521，P＜0.05）；與模型組比較，維拉帕米干預(yù)組及LPS 干預(yù)組大鼠心肌組織中pFoxO3aS253蛋白相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)（F為11.521，P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中Beclin1、LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（F為69.473、20.468，P＜0.05）；與模型組比較，維拉帕米干預(yù)組及LPS 干預(yù)組的大鼠心肌組織中Beclin1、LC3 Ⅰ/Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量下降（F為69.473、20.468，P均＜0.05）。

表2 各組大鼠心肌組織FoxO3a、pFoxO3aS253、Beclin1、LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量（± s）

表2 各組大鼠心肌組織FoxO3a、pFoxO3aS253、Beclin1、LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量（± s）

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3 討論

TLR4是外源性病原體的受體，通過(guò)免疫細(xì)胞啟動(dòng)炎癥，并調(diào)節(jié)MIRI中的細(xì)胞凋亡與自噬相關(guān)發(fā)病機(jī)制。已有研究［11］指出，MIRI 早期炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生取決于TLR4 表達(dá)水平，TLR4 及其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活和炎性反應(yīng)的發(fā)生在MIRI 中起了重要作用。因此，抑制MIRI 誘導(dǎo)的TLR4 表達(dá)并阻斷TLR4 介導(dǎo)的心肌炎癥、細(xì)胞凋亡和自噬可以改善心肌損傷，從而減少M(fèi)IRI 誘導(dǎo)的心肌梗死。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁中的一種特有成分，LPS 本來(lái)是促進(jìn)炎癥反應(yīng)的因素，然而，越來(lái)越多的研究表明，小劑量TLR4 受體激動(dòng)劑LPS 預(yù)處理后，LPS 結(jié)合蛋白（LBP）能夠?qū)PS 轉(zhuǎn)移至CD14，CD14 將LPS聚集體分解成單體分子并呈遞給TLR4-MD-2 復(fù)合物，結(jié)合LPS 后的TLR4-MD-2 復(fù)合物導(dǎo)致多種信號(hào)成分的激活，包括宿主先天免疫反應(yīng)，而當(dāng)再次受到LPS 刺激時(shí)，炎癥反應(yīng)則會(huì)被抑制，這一現(xiàn)象被稱(chēng)為內(nèi)毒素耐受［12］，這也是小劑量LPS 預(yù)處理減輕MIRI的重要作用機(jī)理。

據(jù)報(bào)道，大劑量 LPS 處理可造成膿毒血癥，對(duì)各器官造成一定損傷，而小劑量 LPS 預(yù)處理能對(duì)MIRI 產(chǎn)生一定的保護(hù)作用［13］，其機(jī)制中涉及到炎癥反應(yīng)。研究表明，對(duì)心肌IRI 給予不同劑量的LPS（0.1～1 mg／kg）預(yù)處理可以改善心肌功能，減小心肌梗死面積，從而能對(duì)IRI 心肌產(chǎn)生保護(hù)作用［14-15］。卿羽等［13］研究表明，連續(xù)7 d 腹腔注射1.5 mg/（kg·d）LPS 對(duì)小鼠進(jìn)行預(yù)處理后再誘導(dǎo)MIRI 模型，能夠明顯減小心肌梗死面積，與其升高心肌組織蛋白質(zhì)糖基化修飾水平有關(guān)。CHU等［14］通過(guò)使用LPS預(yù)處理的骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）與未經(jīng)處理的骨髓來(lái)源MSCs 治療MIRI 小鼠后發(fā)現(xiàn)，LPS 預(yù)處理的MSCs比未經(jīng)處理的MSCs具有更好的心功能恢復(fù)效果，對(duì)小鼠的心臟保護(hù)作用更佳。

本研究擬參考上述劑量，建立大鼠IRI 模型，探討小劑量LPS預(yù)處理對(duì)IRI的作用及其機(jī)制，故本研究選擇3 個(gè)劑量（0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg）的LPS 對(duì)大鼠每日進(jìn)行腹腔注射。因維拉帕米可以阻斷鈣離子內(nèi)流，防止線粒體內(nèi)鈣離子超載，減輕缺血再灌注損傷，故設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照組。連續(xù)注射7 d以誘導(dǎo)持續(xù)性炎癥反應(yīng)后再建立MIRI模型，通過(guò)檢測(cè)心功能相關(guān)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，0.1 mg/kg LPS預(yù)處理能夠使大鼠LVPWs 增加，0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg LPS預(yù)處理能夠使大鼠LVIDs、LVESV 減小，LVEF、LVFS 增加，從而改善MIRI 誘導(dǎo)的心功能障礙。此外，經(jīng)過(guò)對(duì)心肌組織進(jìn)行形態(tài)病理學(xué)與心肌梗死面積檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，1 mg/kg LPS預(yù)處理后缺血再灌注大鼠心肌纖維水腫、斷裂、壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度均明顯減輕，0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg LPS 預(yù)處理后缺血再灌注大鼠心肌梗死面積百分比降低，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，提示小劑量LPS 預(yù)處理能夠改善大鼠MIRI癥狀，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。較其他兩個(gè)小劑量組，1 mg/kg LPS 預(yù)處理后缺血再灌注大鼠心肌纖維水腫、斷裂、壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度均明顯減輕。

FoxO3a 參與誘導(dǎo)關(guān)鍵細(xì)胞過(guò)程的靶基因表達(dá)，包括氧化應(yīng)激、葡萄糖代謝、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等，并已知分子可以在翻譯后調(diào)節(jié)FoxO3a的轉(zhuǎn)錄活性。研究表明，F(xiàn)oxO3a 可能在缺血再灌注誘導(dǎo)的組織損傷中起著重要作用，例如，輕度低溫預(yù)處理可增加MIRI 后的蛋白激酶B（AKT）和FoxO3a 的磷酸化水平，并減少細(xì)胞凋亡和炎性細(xì)胞因子釋放，對(duì)肝臟起到保護(hù)作用［15］；間充質(zhì)干細(xì)胞衍生外泌體通過(guò)增加FoxO3a表達(dá)以增強(qiáng)線粒體自噬，從而保護(hù)小膠質(zhì)細(xì)胞免受缺血再灌注誘導(dǎo)的焦亡并減輕神經(jīng)元損傷；缺血再灌注誘導(dǎo)的肝組織中FoxO3a 磷酸化水平降低，川陳皮素通過(guò)激活沉默調(diào)節(jié)蛋白1（SIRT-1）/FoxO3a介導(dǎo)的自噬和線粒體功能從而改善肝缺血再灌注損傷。關(guān)于FoxO3a 在MIRI 中的作用也已有報(bào)道［7］。本研究結(jié)果同樣顯示，0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg LPS 預(yù)處理能夠上調(diào)MIRI 大鼠心肌組織內(nèi)pFoxO3aS253蛋白相對(duì)表達(dá)量，表明FoxO3a 在S253 位點(diǎn)磷酸化，推測(cè)這可能是LPS 預(yù)處理對(duì)MIRI 大鼠發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制。本研究還發(fā)現(xiàn)，相較于直接構(gòu)建MIR 模型大鼠， LPS 預(yù)處理后缺血再灌注大鼠心肌組織中LC3B 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1 相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，由此推測(cè)，小劑量LPS 預(yù)處理能夠抑制MIR 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，該作用可能與抑制自噬水平有關(guān)。本研究3 個(gè)小劑量LPS 預(yù)處理組中1.0 mg/kg 組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1相對(duì)表達(dá)量下調(diào)更明顯，結(jié)合前述病理結(jié)果，在今后研究中選擇1.0 mg/kg LPS預(yù)處理可更好減輕大鼠MIRI。

綜上，小劑量TLR4受體激動(dòng)劑LPS預(yù)處理能夠減輕大鼠MIRI，對(duì)大鼠心臟起保護(hù)作用，該機(jī)制可能與激活FoxO3a 磷酸化及抑制Beclin1、LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白活化有關(guān)，這可能是小劑量LPS 預(yù)處理減輕大鼠MIRI 的機(jī)制之一。但LPS 因其毒性不可直接用于缺血再灌注誘導(dǎo)的器官損傷臨床治療中，且TLR4可能通過(guò)多條信號(hào)通路在MIRI中起作用，充分研究相關(guān)調(diào)控機(jī)制才能更好地為MIRI治療提供思路。