河南省胞內(nèi)分枝桿菌臨床分離株耐藥特征及基因分型

王少華,常文靜,蘇茹月,馬曉光,鄭丹薇,朱巖昆,石 潔,孫國(guó)清,孫定勇,郝義彬

河南省疾病預(yù)防控制中心 鄭州 450016

非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)指除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌[1]。NTM在環(huán)境中分布廣泛,并且對(duì)大多數(shù)抗結(jié)核藥物天然耐受[2]。NTM中,鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumaviumcomplex,MAC)是致病NTM中全球分布最廣的分枝桿菌,一項(xiàng)對(duì)25篇文獻(xiàn)報(bào)道的共38 686株NTM分離株的分析結(jié)果顯示,MAC在大洋洲的分離率達(dá)到61%,北美洲為51%,非洲為49%,亞洲、南美洲和歐洲達(dá)到34%[3];課題組前期研究[4]也表明河南省NTM分離株中MAC占比達(dá)78.5%。根據(jù)Runyon分類原則,MAC屬于慢生長(zhǎng)型NTM,不產(chǎn)色。MAC中最重要的致病菌有鳥分枝桿菌(M.avium)、胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare)和奇美拉分枝桿菌(M.chimaera)[5]。MAC亞種間的臨床特征、毒性、致病能力及對(duì)抗菌藥物的體外抗性差異較大[6],因此在臨床中需要對(duì)分離的菌株進(jìn)行鑒定。

可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable-number tandem repeat,VNTR)分型是一種以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分型方法,其操作簡(jiǎn)單,分辨率高,具有很高的可重復(fù)性,已廣泛用于分枝桿菌的基因分型,包括結(jié)核分枝桿菌[7-8]、胞內(nèi)分枝桿菌等[9]。本研究對(duì)河南省部分地市的胞內(nèi)分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行菌種鑒定,藥敏試驗(yàn)和分子分型分析,旨在為胞內(nèi)分枝桿菌感染性疾病的臨床診治和分子流行病學(xué)防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源68株來源于2019年河南省部分地市結(jié)核病專科醫(yī)院患者痰標(biāo)本分離的胞內(nèi)分枝桿菌菌株,其中南陽市37株、平頂山市6株、鄭州市5株、洛陽市3株、周口市3株、駐馬店市3株、許昌市3株、信陽市2株、濮陽市2株、鶴壁市2株、開封市2株。

1.2 菌種鑒定用接種環(huán)刮取L-J羅氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的分枝桿菌懸于超純水中,95 ℃金屬浴裂解20 min,12 000 r/min離心10 min,取上清備用(-20 ℃冷凍保存)。采用熔解曲線法分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(廈門致善生物科技股份有限公司)進(jìn)行菌種鑒定,該試劑盒可用于臨床和環(huán)境中常見的19種分枝桿菌的定性鑒定[10]。具體操作參照試劑盒說明書。采用16S rRNA、rpoB、ITS(16S～23S rRNA internal transcribed spacer)和hsp65基因聯(lián)合測(cè)序?qū)N進(jìn)行鑒定,引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司(Sangon公司)參考文獻(xiàn)[11]設(shè)計(jì)、合成。PCR反應(yīng)體系(50 μL):PCR預(yù)混液2×Mix(康為世紀(jì)生物科技有限公司)25 μL,上下游引物各2 μL,DNA模板5 μL,無菌去離子水 16 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性94 ℃ 5 min;94 ℃ 60 s,60 ℃ 60 s,72 ℃ 60 s,共計(jì)35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸 7 min。由Sangon公司測(cè)序,將基因序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性分析、比對(duì)、判定,相似度≥97%即可確定菌種。

1.3 藥物敏感性測(cè)定使用含16種預(yù)制凍干藥品的貝索96孔藥敏板(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行藥敏試驗(yàn),包括阿米卡星、阿莫西林/克拉維酸、利福平、頭孢西丁、利福布汀、環(huán)丙沙星、克拉霉素、多西環(huán)素、亞胺培南、利奈唑胺、米諾環(huán)素、莫西沙星、替加環(huán)素、妥布霉素、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑和美羅培南。具體操作參照說明書。藥物最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)范圍和臨界值的判定參照文獻(xiàn)[12]和說明書。

1.4 VNTR分型及聚類分析采用16個(gè)VNTR基因位點(diǎn)方法進(jìn)行分型分析[9]。引物由Sangon公司合成。PCR反應(yīng)體系同1.2。反應(yīng)條件:預(yù)變性94 ℃ 10 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共計(jì)38個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳,以確定其大小(以M.intracellulareATCC 13950為對(duì)照)。根據(jù)等位基因大小和基本單位長(zhǎng)度計(jì)算等位基因重復(fù)數(shù)。使用Selander多樣公式[13]計(jì)算每個(gè)基因座等位基因多樣性指數(shù)(h),參考文獻(xiàn)[14]計(jì)算漢高指數(shù)(Hunter-Gaston discriminatory index,HGDI)。使用BioNumerics 8.1(Applied Maths,SintMartensLatem,Belgium)軟件對(duì)VNTR數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Excel 2010對(duì)資料進(jìn)行整理,采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)比較成簇菌株和非成簇菌株耐藥率的差異,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 菌種鑒定結(jié)果經(jīng)鑒定,68株均為胞內(nèi)分枝桿菌。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果見圖1。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,克拉霉素、利福布汀和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑?qū)Π麅?nèi)分枝桿菌具有較好的抗菌作用,耐藥率分別為11.76%(8/68)、5.88%(4/68)、8.82%(6/68),克拉霉素的抑制50%胞內(nèi)分枝桿菌的MIC(MIC50)和MIC90分別為2和32 mg/L,利福布汀分別為0.5和2 mg/L,甲氧芐啶/磺胺甲惡唑分別為0.25/4.75和2/38 mg/L。同時(shí)耐藥4種以上的菌株占95.59%(65/68),耐藥6種以上的菌株占67.65%(46/68),耐藥8種以上的菌株占16.18%(11/68);有兩株(2.94%,2/68)全耐藥。

圖1 68株胞內(nèi)分枝桿菌16種藥物的MIC(mg/L)分布

2.3 VNTR分型結(jié)果VNTR基因座的等位基因多樣性差異很大,h從0.014到0.590,詳見表1。在16個(gè)VNTR位點(diǎn)中,有3個(gè)位點(diǎn)(VNTR7、12、13)h>0.500。

表1 68株胞內(nèi)分枝桿菌VNTR等位基因分布 株

2.4 VNTR聚類分析結(jié)果經(jīng)VNTR聚類分析,68株分為45個(gè)基因型,其中34株來自11個(gè)簇(成簇菌株),34株為獨(dú)特模式的分離株(非成簇菌株)。68株的HGDI為0.978,見圖2。最小生成樹結(jié)果表明53株構(gòu)成一個(gè)大簇,其余15株位于該簇周圍,見圖3。

圖2 68株胞內(nèi)分枝桿菌16位點(diǎn)VNTR分型聚類圖

圖3 根據(jù)68株胞內(nèi)分枝桿菌VNTR結(jié)果構(gòu)建的最小生成樹

2.5 成簇和非成簇菌株的耐藥率比較見表2。成簇菌株中利奈唑胺和阿米卡星耐藥率高于非成簇菌株(P<0.05)。成簇菌株和非成簇菌株中克拉霉素、莫西沙星、利福平、利福布汀、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、妥布霉素、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素和米諾環(huán)素耐藥率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 成簇和非成簇菌株耐藥率的比較 耐藥株數(shù)(%)

*校正χ2;#:確切概率。

3 討論

臨床上,大多數(shù)NTM對(duì)常見抗結(jié)核藥物耐藥。我國(guó)2020版《非結(jié)核分枝桿菌病診斷與治療指南》對(duì)于MAC感染者,推薦聯(lián)合使用大環(huán)內(nèi)酯類(阿奇霉素或克拉霉素)、利福平(利福布汀)、乙胺丁醇等藥物,并根據(jù)病情變化加用氨基糖苷類藥物(阿米卡星)[15]。本研究結(jié)果顯示,河南省胞內(nèi)分枝桿菌臨床分離株對(duì)克拉霉素的耐藥率為11.76%,高于王淑琦等[16]的2.67%和Lin等[17]的3.7%,與Zhao等[18]的9.6%和李遠(yuǎn)春等[19]的9.28%相當(dāng)。大環(huán)內(nèi)酯類是主要的抗NTM藥物,臨床治療結(jié)果也表明其對(duì)MAC感染有較好的效果[20-21]。本研究中利福平的耐藥率為97.06%,與Lin等[17]的79.0%相近,高于Zhao等[18]的21.2%,這可能與采取的臨界質(zhì)量濃度不同有關(guān)。本研究使用預(yù)制的藥敏板,利福平的耐藥臨界質(zhì)量濃度為2 mg/L,而Zhao等[18]用的臨界質(zhì)量濃度為8 mg/L。本研究中利福布汀的耐藥率為5.88%,與肖士林等[22]的4.6%相當(dāng);甲氧芐啶/磺胺甲惡唑的耐藥率為8.82%,遠(yuǎn)低于Song等[23]的39.29%。由于不同菌株耐藥性差異較大,因此治療前需進(jìn)行藥敏試驗(yàn),為臨床治療提供必要的支持。

本研究對(duì)68株進(jìn)行了VNTR分型分析,結(jié)果表明,位點(diǎn)VNTR 7、12、13的h>0.500。王淑琦等[16]的研究中VNTR 7、11～13及15的h>0.500;Zhao等[18]的研究中VNTR 4、5、7、10、11、15和16的h>0.500;Zheng等[24]報(bào)道,除了VNTR 7和11外,其他位點(diǎn)的h>0.500;Lari等[25]的研究顯示位點(diǎn)VNTR 2、3、4、5、7、9、10和13的h>0.500。這表明各地菌株構(gòu)成遺傳特異性有較大的差異。

本研究68株胞內(nèi)分枝桿菌臨床分離株被分為45個(gè)基因型,包括來自11個(gè)簇的34個(gè)菌株和34個(gè)獨(dú)特模式的分離株。胞內(nèi)分枝桿菌分離株VNTR分型的HGDI值為0.978,與Zheng等[24]的0.995和Lari等[25]的0.993相當(dāng),表明分型方法具有較高的分辨力。與Lari等[25]的結(jié)果不同,本研究中最小生成樹僅由一個(gè)53株菌的大簇構(gòu)成,表明各地的胞內(nèi)分枝桿菌菌株的多樣性存在差異。利奈唑胺和阿米卡星耐藥率在成簇菌株中高于非成簇菌株。Zhao等[18]報(bào)道莫西沙星耐藥率在成簇菌株中高于非成簇菌株;Zheng等[24]的研究表明左氧氟沙星非成簇菌株對(duì)的耐藥性高于成簇菌株;而王淑琦等[16]的研究結(jié)果顯示成簇菌株與非成簇菌株耐藥率沒有差異。

綜上,本研究結(jié)果表明,克拉霉素、利福布汀和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑等對(duì)河南省胞內(nèi)分枝桿菌臨床分離株具有較好的抗菌活性,VNTR分型方法對(duì)胞內(nèi)分枝桿菌臨床分離株具有較好的分型能力,成簇菌株對(duì)利奈唑胺和阿米卡星的耐藥率高于未成簇菌株。