胎兒末端染色體非平衡易位遺傳方式的CNV-seq聯合G顯帶核型分析

侯雅勤,時盼來,代 鵬,陳 鐸,白 瑩,孔祥東

鄭州大學第一附屬醫院遺傳與產前診斷中心 鄭州 450052

末端染色體非平衡易位(terminal non-balanced chromosomal translocation,TNCT)指染色體末端分別存在缺失和重復,可導致產前超聲胎兒結構異常,流產和患兒發育遲滯、心臟異常、智力低下等[1]。TNCT的原因可能是父母染色體平衡易位,也可能是胎兒新發變異。染色體平衡易位攜帶者具有隱匿性,攜帶者本人多表型和智力正常,但是與核型正常的配偶婚育,增加了流產和染色體非平衡患兒出生的風險[2]。

目前關于TNCT多為單個病例的報道[3-4],缺乏遺傳方式統計和溯源分析。本研究采用胎兒拷貝數變異檢測(copy number variation sequencing,CNV-seq)和父母G顯帶核型分析技術,探究TNCT的發生率、遺傳方式,并為臨床遺傳咨詢提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2018年6月至2021年12月在鄭州大學第一附屬醫院遺傳與產前診斷中心進行產前診斷或流產的胎兒17 248例,經CNV-seq檢測,結果為兩條末端染色體分別存在缺失和重復的TNCT胎兒88例,其中59例胎兒父母自愿進行G顯帶核型分析或原位熒光雜交技術(fluorescence in situ hybridization,FISH)檢測。所有家屬均簽署知情同意書,本研究獲得該院醫學倫理委員會批準,批準號:2019-KY-418。

1.2 標本采集超聲引導下經腹行羊膜腔穿刺術取絨毛或羊水,用于CNV-seq和短串聯重復序列(short tandem repeat,STR)位點檢測,留存3 mL羊水離心后凍存備份。取流產胎兒絨毛或皮膚組織,用生理鹽水清洗后,進行CNV-seq和STR位點檢測。

1.3 CNV-seq和STR位點檢測使用DNA提取試劑盒提取羊水或絨毛DNA,并測定DNA濃度。經STR檢測(基點認知技術有限公司),均無母源和外源污染,進行CNV-seq檢測。使用染色體CNV-seq檢測試劑盒(北京貝瑞和康生物技術有限公司)進行文庫構建、文庫定量與混合后,用基因測序儀(Nextseq CN 500)進行高通量測序。依據2019年美國醫學遺傳學與基因組學學會評分指南[5]進行CNV分析。

1.4 G顯帶核型分析和FISH檢測G顯帶核型分析:取父母的肝素鋰抗凝外周血,進行外周血淋巴細胞培養。參照ISCN2020對平衡易位核型進行描述,計數25個核型,分析5個核型,由具備產前診斷資質人員出具診斷報告。

FISH檢測:父母外周血淋巴細胞經培養,制片,用定制FISH探針原位雜交、洗脫及封片后,在熒光顯微鏡下觀察結果。FISH定制探針和試劑由北京貝康醫學檢驗所提供。

2 結果

17 248例中88例(49例產前診斷和39例流產病例)檢出TNCT,檢出率為0.51%。其中59例(30例產前和29例流產病例)行G顯帶核型分析或FISH檢測,結果顯示32例(54.24%)為父母染色體平衡易位,27例(45.76%)為胎兒新發變異,59例的CNV-seq和遺傳方式見表1、2和圖1～3。

圖1 R6胎兒父親(左)和母親(右)G顯帶核型分析結果

圖2 R6胎兒CNV-seq結果

圖3 R6胎兒父親FISH檢測結果

表1 產前診斷病例CNV-seq檢測結果和遺傳方式

表2 流產病例CNV-seq檢測結果和遺傳方式

49例產前病例中,28例胎兒超聲異常,其中頸項透明層(nuchal translucency,NT)增厚11例;無創產前基因檢測技術(NIPT)高風險12例,僅次于超聲異常。39例流產病例中,35例為孕早期胚胎停育或無胎心,4例為孕中期胎兒超聲嚴重結構異常,1例為NT增厚。

3 討論

本研究17 248例中共檢出88例TNCT,檢出率為0.51%;對其中59例進行溯源分析,發現32例(54.24%)為父母染色體平衡易位導致,27例(45.76%)為胎兒新發變異。染色體平衡易位攜帶者由于相互易位的染色體在減數分裂期間形成四射體,產生大量異常配子[6],生育TNCT后代的概率較大。但是對于父母核型正常而胎兒為TNCT的家系,其發生原因可能是父母生殖腺嵌合,即外周血核型正常,生殖細胞為平衡易位核型。目前報道生殖腺嵌合的多為非整倍體異常和基因突變病例[7-9],未見平衡易位的報道。父母染色體核型正常,受精卵在后期分裂中發生易位也可能導致胚胎新發異常。本研究顯示R16、R21、F27和F29等9例胎兒的TNCT是嵌合型,異常比例為30%～70%,其父母染色體核型均為正常,推測易位可能發生于形成受精卵之后。但也有胎兒嵌合TNCT是由于父母染色體平衡易位導致的報道[10]。目前未見對易位發生在受精卵形成之前還是之后的研究,因此胎兒新發非平衡易位機制尚需進一步研究。

TNCT胎兒在產前多表現為超聲異常[1]。本研究中胎兒超聲異常28例,以NT增厚最為常見。NT增厚提示染色體異常、胎兒心臟和其他結構畸形等風險增加[11]。CNV-seq檢測不僅揭示了胎兒超聲異常遺傳學原因,還可以預測妊娠結局。對于CNV-seq結果正常且不伴其他結構異常的單純NT增厚,妊娠結局大多良好[12]。而對于CNV-seq結果為致病性的胎兒,應在孕早期終止妊娠,減少異常胎兒給孕婦和家庭帶來的傷害。

染色體平衡易位攜帶者遺傳物質總量保持不變,除非斷裂點存在致病基因,多無明顯表型,部分伴有不良孕產史,具有較強的隱匿性[13]。G顯帶核型分析目前是檢測平衡易位的經典技術,但其準確度依賴于核型制備技術和分析人員的專業能力,有一定的局限性。本研究R6胎兒父母的核型均未見明顯異常,根據胎兒CNV-seq結果設計FISH探針,診斷為父方11號和17號染色體平衡易位。由于易位片段大小相近,條帶形態類似,導致平衡易位的核型與正常核型難以分辨,這類誤判在以往多有報道[14-15]。因此結合胎兒CNV-seq結果,對父母進行核型分析或FISH檢測,可以減少漏檢。

平衡易位家系多有不良孕產史,給孕婦身體和心理帶來極大的創傷,多發異常患兒的出生給家庭和社會帶來沉重的負擔。本研究顯示88例TNCT胎兒中,僅有6個(6.8%)家系是已知平衡易位攜帶者,59個(67.05%)家系選擇溯源分析并明確了再次妊娠的風險。

本研究聯合CNV-seq和G顯帶核型分析技術,統計了TNCT的發生率,有利于增強臨床和產前篩查研究者對TNCT的認識和重視程度,可為臨床遺傳咨詢提供依據。通過對TNCT胎兒父母進行溯源分析,提高了平衡易位攜帶者的檢出率,針對這類家庭進行遺傳指導,可避免不良孕產結局,對降低缺陷胎兒孕育和提高人口素質具有重要意義。