富含蘿卜硫素的西蘭花提取物對(duì)小鼠外周血CD8+T淋巴細(xì)胞活化及腸道菌群的影響

王 政,申春一,黃建敏,劉金燕,李潔瑤,張 毅1,

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052

蘿卜硫素(sulforaphane,SFN)是廣泛存在于西蘭花、卷心菜和花椰菜等植物性食物中的一種抗氧化劑。體內(nèi)外研究[1]發(fā)現(xiàn),SFN可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng),調(diào)動(dòng)體內(nèi)的CD8+T淋巴細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞,增強(qiáng)抗腫瘤的免疫反應(yīng)。此外,SFN還具有抗氧化、保護(hù)胃腸道、預(yù)防高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化等作用,在疾病預(yù)防及治療領(lǐng)域具有重要潛力[2-3]。腸道作為食物消化吸收的主要場(chǎng)所,其中含有眾多微生物。腸道微生物是連接宿主及外界環(huán)境的橋梁,除了維持腸道正常消化功能以外,還通過(guò)各類(lèi)代謝物參與宿主生理病理過(guò)程[4]。腸道微生物與宿主相互依存,共同進(jìn)化,形成抵抗外來(lái)病原體的屏障,并且可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答以及增強(qiáng)代謝健康[5-7]。CD8+T淋巴細(xì)胞是機(jī)體主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞,腸道中有益菌比例的增加可以刺激體內(nèi)CD8+T淋巴細(xì)胞分泌效應(yīng)因子,提高腫瘤免疫的治療效果[8]。本研究使用一種富含SFN的西蘭花提取物作為膳食補(bǔ)充劑,探究長(zhǎng)期攝入該提取物對(duì)健康小鼠腸道菌群及外周血CD8+T淋巴細(xì)胞活性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器蒸餾水、不含SFN的西蘭花提取物、含0.3 g/L SFN的西蘭花提取物,由普洱祺云生物科技有限公司提供。FITC標(biāo)記的CD45單抗、BV510標(biāo)記的CD3單抗、AF700標(biāo)記的CD8單抗、PE-Cy7標(biāo)記的CD69單抗、BV421標(biāo)記的IL-2單抗、BV785標(biāo)記的TNF-α單抗和Zombie NIR Fixable Viability試劑盒購(gòu)自北京Biolegend公司。DxFLEX 流式細(xì)胞儀為美國(guó)Beckman Coulter公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組雌性4周齡C57BL/6N小鼠購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,合格證編號(hào):20210714Abzz0619000778。將15只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(control group,CON)、陰性對(duì)照組(negative control,NC)、SFN組,每組5只。SFN組給予含0.3 g/L SFN的西蘭花提取物125 μL灌胃。NC組和CON組分別給予不含SFN的西蘭花提取物及蒸餾水125 μL灌胃。每天灌胃1次,連續(xù)4周。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)鄭州大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 體重測(cè)量實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后每2 d測(cè)量1次小鼠體重,均在灌胃前進(jìn)行。

1.4 外周血采集與指標(biāo)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)最后1天,將小鼠尾尖部剪去約 0.5 mm,從尾根向尾尖擠壓按摩取血。

1.4.1CD8+T淋巴細(xì)胞活化情況 向小鼠尾靜脈血中加入紅細(xì)胞裂解液,室溫孵育10 min,離心后棄上清,得到外周血單個(gè)核細(xì)胞,加入FITC標(biāo)記的CD45單抗、BV510標(biāo)記的CD3單抗、AF700標(biāo)記的CD8單抗和PE-Cy7標(biāo)記的CD69單抗并混勻,室溫孵育15 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè),以CD45+CD3+CD8+CD69+T淋巴細(xì)胞為活化的CD8+T淋巴細(xì)胞細(xì)胞,計(jì)算活化的CD8+T淋巴細(xì)胞百分比。

1.4.2CD8+T淋巴細(xì)胞中IL-2和TNF-α含量 取適量外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)表面抗原染色篩選出CD8+T淋巴細(xì)胞后,加入細(xì)胞固定液,避光放置20 min;洗滌2次,用100 μL的細(xì)胞破膜劑重懸、孵育30 min,加入BV421標(biāo)記的IL-2單抗、BV785標(biāo)記的TNF-α單抗,避光孵育30 min;洗滌后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。使用平均熒光強(qiáng)度表示CD8+T淋巴細(xì)胞中IL-2及TNF-α的含量。

1.5 腸道菌群分析實(shí)驗(yàn)結(jié)束前采集3只小鼠的新鮮糞便,于-80 ℃冰箱保存。 基因擴(kuò)增及后續(xù)生物信息學(xué)分析均由上海百趣生物醫(yī)學(xué)科技有限公司提供。通過(guò)OmicShare Tools進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)、主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)以及非度量多維尺度(non-metric multidimensional scaling,NMDS)分析。PCoA中使用Bray-Curtis距離矩陣反映兩個(gè)群落之間的差異性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 9.1.1分析數(shù)據(jù)。各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重的比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析,活化的CD8+T淋巴細(xì)胞百分比、IL-2和TNF-α含量及腸道菌群相對(duì)豐度的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析衡量IL-2和TNF-α含量與腸道菌群相對(duì)豐度的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠體重變化3組小鼠體重均逐漸增加,各時(shí)間點(diǎn)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

F組間=2.640,P=0.177;F時(shí)間=21.070,P<0.001;F交互=1.261,P=0.330。

2.2 3組小鼠CD8+T淋巴細(xì)胞活化情況SFN組小鼠外周血活化的CD8+T淋巴細(xì)胞百分比,IL-2、TNF-α含量高于CON組及NC組(表1)。

表1 3組活化的CD8+T淋巴細(xì)胞百分比和IL-2、TNF-α含量比較

2.3 3組小鼠腸道菌群組成分析3組小鼠腸道菌群組成有明顯區(qū)別(圖2)。

圖2 3組小鼠腸道菌群組成的PCA、PCoA、NMDS分析結(jié)果

2.4 3組小鼠腸道菌群組成分析

2.4.1基于門(mén)水平的腸道菌群組成 見(jiàn)圖3。門(mén)水平上,CON組小鼠優(yōu)勢(shì)菌群為擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes),NC組及SFN組小鼠優(yōu)勢(shì)菌群為擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobiota)及放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteriota)。SFN組疣微菌門(mén)相對(duì)豐度高于CON組及NC組,見(jiàn)表2。

表2 3組小鼠疣微菌門(mén)及阿克曼菌屬相對(duì)豐度的比較 %

圖3 3組小鼠基于門(mén)水平的腸道菌群組成分析

2.4.2基于屬水平的腸道菌群組成 見(jiàn)圖4。屬水平上,CON組小鼠優(yōu)勢(shì)菌群有未分類(lèi)的Muribaculaceae屬(Muribaculaceae_unclassified)、乳桿菌屬(Ligilactobacillus)、另枝菌屬(Alistipes)和薩科瑞莫納斯屬(Candidatus_Saccharimonas)等。NC組小鼠優(yōu)勢(shì)菌群有未分類(lèi)的Muribaculaceae屬、乳桿菌屬、阿克曼菌屬(Akkermansia)和腸桿菌屬(Enterorhabdus)等。SFN組小鼠腸道優(yōu)勢(shì)菌群有未分類(lèi)的Muribaculaceae屬、乳桿菌屬、阿克曼菌屬、未分類(lèi)的梭菌屬_UCG-014(Clostridia_UCG-014_unclassified)等。SFN組小鼠腸道中阿克曼菌屬相對(duì)豐度大于NC和CON組,見(jiàn)表2。

圖4 3組小鼠基于屬水平的腸道菌群組成

2.5 外周血CD8+T淋巴細(xì)胞IL-2及TNF-α的含量與腸道阿克曼菌屬相對(duì)豐度的相關(guān)性腸道阿克曼菌屬的相對(duì)豐度與外周血CD8+T淋巴細(xì)胞中IL-2及TNF-α的含量呈正相關(guān)(r=0.934和0.664,P<0.05),見(jiàn)圖5。

圖5 外周血CD8+T淋巴細(xì)胞中IL-2和TNF-α含量與腸道阿克曼菌屬相對(duì)豐度的相關(guān)性

3 討論

SFN是來(lái)源于植物的一種營(yíng)養(yǎng)素,對(duì)免疫系統(tǒng)有多種作用。它一方面可以減輕腸炎小鼠的腸道炎癥反應(yīng)[9],抑制輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病[10];另一方面可以通過(guò)增強(qiáng)效應(yīng)T細(xì)胞的功能,抑制髓源抑制性細(xì)胞,進(jìn)而增強(qiáng)抗腫瘤作用[1]。

腸道菌群作為機(jī)體“第二基因組”,參與機(jī)體的各種生理活動(dòng)。研究[11]發(fā)現(xiàn),腸道菌群是調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因素之一,一些有益菌能夠調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的功能,增強(qiáng)其對(duì)病原體的清除能力。結(jié)直腸癌、乳腺癌患者腸道內(nèi)乳桿菌、梭菌等可通過(guò)其代謝物促進(jìn)CD8+T淋巴細(xì)胞的抗腫瘤作用[8,12]。

本研究結(jié)果顯示,連續(xù)攝入富含SFN的西蘭花提取物對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)無(wú)影響,說(shuō)明長(zhǎng)期連續(xù)攝入富含SFN的西蘭花提取物對(duì)小鼠生長(zhǎng)無(wú)損害;腸道菌群分析結(jié)果顯示,連續(xù)攝入富含SFN的西蘭花提取物后小鼠腸道中疣微菌門(mén)和阿克曼菌屬的相對(duì)豐度明顯增加;SFN組CD8+T淋巴細(xì)胞中IL-2和TNF-α含量增高,且阿克曼屬菌相對(duì)豐度與CD8+T淋巴細(xì)胞中IL-2和TNF-α含量呈正相關(guān)。

阿克曼菌屬包含許多腸道有益菌,如嗜黏蛋白阿克曼菌。該菌以腸道表面黏蛋白作為氮源、碳源和能量來(lái)源,可以保護(hù)腸道屏障的完整性[13],缺乏會(huì)引起一系列疾病[14]。在腫瘤治療過(guò)程中,腸道中的阿克曼菌可以增強(qiáng)腫瘤對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的應(yīng)答[15],它分泌的胞外囊泡也可以提高CD8+T淋巴細(xì)胞的比例,抑制前列腺癌的增殖[16]。結(jié)合本研究結(jié)果推測(cè),通過(guò)攝入SFN增加腸道阿克曼菌屬的相對(duì)豐度,進(jìn)一步活化外周血CD8+T淋巴細(xì)胞,或許可以輔助抗腫瘤。

綜上所述,長(zhǎng)期攝入富含SFN的西蘭花可以調(diào)節(jié)宿主腸道菌群,通過(guò)提高腸道中阿克曼菌屬的相對(duì)豐度,促進(jìn)CD8+T淋巴細(xì)胞活化,增強(qiáng)清除病原體的能力。本研究有助于SFN相關(guān)益生菌產(chǎn)品的開(kāi)發(fā),為后續(xù)藥物研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。