circPDE3B在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及對癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

鄭釗洋,王獻(xiàn)增,張 曼,陳雙雙,楊 瑩,劉紅春

1)河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科 鄭州 450002 2)林州市人民醫(yī)院胸外科 河南安陽 456550 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科 鄭州 450052

我國是世界上食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)高發(fā)國家之一,ESCC患者的5 a生存率僅有20%～35%,且復(fù)發(fā)風(fēng)險較高[1-2]。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA,在人體組織中廣泛表達(dá)[3]。研究[4]表明,circRNA在惡性腫瘤中異常表達(dá),并且可作為蛋白質(zhì)誘餌、miRNA海綿參與轉(zhuǎn)錄和剪接的調(diào)節(jié),參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有研究[5-7]發(fā)現(xiàn)多種circRNA在ESCC進(jìn)展中起重要作用。本研究檢測ESCC組織和細(xì)胞中circPDE3B的表達(dá),構(gòu)建敲低circPDE3B表達(dá)的KYSE150細(xì)胞,探討circPDE3B對ESCC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響;采用雙熒光素酶報告實驗驗證circPDE3B靶向miR-1294的結(jié)合位點,探討circPDE3B/miR-1294調(diào)控軸對ESCC發(fā)生發(fā)展的影響,以期為食管癌早期診斷標(biāo)志物以及潛在治療靶點的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床組織標(biāo)本選取2020年1月至2022年1月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床病理信息完整的ESCC患者30例,其中男21例,女9例,年齡45～83歲。在手術(shù)切除之前,患者均未接受過化學(xué)治療、放射治療或免疫治療,所有患者均在手術(shù)前簽署知情同意書。本研究由該院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(2021-KY-1131-002)。收集切除的癌組織及相應(yīng)的癌旁(距原發(fā)灶5 cm以外)正常食管組織,用以檢測circPDE3B的表達(dá)。

1.2 細(xì)胞和主要試劑ESCC細(xì)胞系KYSE30、EC9706、ECA109、KYSE150,正常食管上皮細(xì)胞系HEEC和人胚胎腎細(xì)胞系293T均購自上海市生命科學(xué)院細(xì)胞中心;RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素-鏈霉素購自上海源培生物科技股份有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司;si-circRNA、si-NC、miR-1294 inhibitor、inhibitor NC、miR-1294 mimic及mimic NC均購自上海吉瑪制藥有限公司;雙熒光素酶報告實驗試劑盒購自美國Promega公司;Trizol試劑和Lipofectamine 3000試劑盒購自美國Invitrogen公司;CCK-8試劑盒購自武漢亞科因生物科技有限公司;基質(zhì)膠和Transwell小室購自美國Corning公司。

1.3 組織和細(xì)胞中circPDE3B和miR-1294表達(dá)的qRT-PCR檢測使用Trizol提取組織和細(xì)胞中的總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后進(jìn)行qPCR。反應(yīng)體系20 μL:上、下游引物各1 μL, SuperMix 10 μL,模板1 μL,RNase Free Water 7 μL;反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,40個循環(huán);最終72 ℃ 10 min中止反應(yīng)。qPCR在QuantStudio 12K Flex系統(tǒng)上進(jìn)行。采用2-ΔΔCt法測定靶基因相對表達(dá)水平。以GAPDH作為circPDE3B的內(nèi)參基因,U6作為miR-1294的內(nèi)參基因。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)KYSE150細(xì)胞,細(xì)胞復(fù)蘇貼壁后每隔3 d傳代1次。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以2×105個/孔的密度接種到60 mm培養(yǎng)板上,細(xì)胞融合度達(dá)50%～60%時,采用Lipofectamine 3000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染,嚴(yán)格按照試劑說明書操作,分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-circPDE3B#1、si-circPDE3B#2、si-circPDE3B#1+inhibitor NC、si-circPDE3B#1+miR-1294 inhibitor 48 h。

1.5 細(xì)胞增殖的CCK-8法檢測將轉(zhuǎn)染第1、2、3、4天后的KYSE150細(xì)胞接種到96孔板中,每孔注入100 μL細(xì)胞懸液(3×104個/mL),孵育24 h后加入10 μL CCK-8溶液,2 h后用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值。實驗重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞克隆形成實驗轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞以1 000個/孔的密度接種到12孔板,孵育10 d后取出,PBS沖洗,多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色,Image J軟件計數(shù)克隆形成的細(xì)胞團(tuán)數(shù)量。每個克隆直徑0.3～1.0 mm,含有50個以上的細(xì)胞團(tuán)。實驗重復(fù)3次。

1.7 劃痕實驗當(dāng)KYSE150細(xì)胞融合達(dá)到90%～100%時,用200 μL吸管尖端在細(xì)胞板上畫三條相互平行的軌跡。PBS沖洗,加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。觀察劃痕實驗中細(xì)胞愈合情況,48 h后比較劃痕愈合率。劃痕愈合率=(初始劃痕面積-48 h后劃痕面積)/初始劃痕面積×100%。實驗重復(fù)3次。

1.8 細(xì)胞遷移和侵襲的Transwell實驗用基質(zhì)膠覆蓋的Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲實驗,不覆蓋的進(jìn)行細(xì)胞遷移實驗。以無胎牛血清的培養(yǎng)基調(diào)整KYSE150細(xì)胞密度為2×105個/mL。取200 μL細(xì)胞懸液接種于上室,底部小室裝入650 μL含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的培養(yǎng)基,孵育36～48 h后取出,用多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色。在100倍倒置顯微鏡下拍攝,并用Image J軟件計數(shù)跨膜細(xì)胞。實驗重復(fù)3次。

1.9 雙熒光素酶報告實驗擴(kuò)增野生型circPDE3B(circPDE3B WT)或突變型circPDE3B(circPDE3B MUT)序列,并將其插入到pmirGLO雙熒光素酶載體中。將上述報告載體分別與miR-1294 mimic或mimic NC共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。48 h后使用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理ESCC組織和癌旁正常食管組織中circPDE3B表達(dá)的比較采用配對樣本t檢驗;5種細(xì)胞中circPDE3B表達(dá),si-NC組、si-circPDE3B#1和si-circPDE3B#1+inhibitor NC組,以及si-NC組、si-circPDE3B#1、si-circPDE3B#1+inhibitor NC組和si-circPDE3B#1+miR-1294 inhibitor組細(xì)胞增殖能力、克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)的比較均采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。

檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ESCC組織和細(xì)胞中circPDE3B的表達(dá)ESCC組織中circPDE3B的表達(dá)(3.07±2.95)高于癌旁正常食管組織(1.45±1.34)(t配對=2.879,P=0.007);與HEEC細(xì)胞相比, EC9706、ECA109和KYSE150細(xì)胞中circPDE3B的表達(dá)升高,KYSE150細(xì)胞最高(表2)。選擇KYSE150細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

表2 5種食管上皮細(xì)胞中circPDE3B的表達(dá)

2.2 敲低circPDE3B表達(dá)對KYSE150細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響與si-NC組比較,si-circPDE3B#1和si-circPDE3B#2組細(xì)胞增殖受抑,circPDE3B表達(dá)降低,克隆形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)減少,劃痕愈合率降低(表3、4)。

表3 3組KYSE150細(xì)胞吸光度值比較

表4 3組KYSE150細(xì)胞circPDE3B表達(dá)、克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)比較

2.3 circPDE3B和miR-1294靶向關(guān)系驗證通過CircInteractome數(shù)據(jù)庫預(yù)測出circPDE3B可靶向miR-1294的結(jié)合位點(圖1)。將攜帶circPDE3B WT和circPDE3B MUT的報告載體分別與miR-1294mimic和mimic NC共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞內(nèi),結(jié)果顯示circPDE3B WT和miR-1294 mimic共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性降低(表5)。

圖1 circPDE3B與miR-1294的靶向關(guān)系

表5 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果(n=3)

2.4 miR-1294 inhibitor對敲低circPDE3B表達(dá)的KYSE150細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響與si-NC組比較,si-circPDE3B#1和si-circPDE3B#1+inhibitor NC組KYSE150細(xì)胞增殖受抑,克隆形成細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)減少,劃痕愈合率降低;miR-1294 inhibitor可部分逆轉(zhuǎn)以上變化(表6、7)。

表6 4組KYSE150細(xì)胞吸光度值比較

表7 4組KYSE150細(xì)胞克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)比較

3 討論

多項研究[8-10]表明circRNA在食管癌中異常表達(dá),并且能夠通過“海綿作用”調(diào)控下游miRNA的表達(dá),進(jìn)而抑制或促進(jìn)食管癌的進(jìn)展。食管癌組織中circ_0006168高表達(dá),且能夠靶向調(diào)節(jié)miR-100/mTOR,促進(jìn)食管癌的進(jìn)展[11];高表達(dá)circ_0004771可通過作用于miR-339-5p/CDC25A通路,從而調(diào)節(jié)惡性食管癌的進(jìn)展[12];在食管癌組織和細(xì)胞中,高表達(dá)的circ_0006948可直接與miR-490-3p結(jié)合,靶向癌基因高遷移率蛋白A2的3＇UTR,進(jìn)而誘導(dǎo)食管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[13]。本研究結(jié)果顯示ESCC組織和細(xì)胞中circPDE3B表達(dá)升高,敲低circPDE3B可以抑制ESCC細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力。

作為一組內(nèi)源性非編碼小RNA分子,miR-1294在食管癌中的異常表達(dá)越來越受到重視[14-16]。Zong等[17]發(fā)現(xiàn),LncRNA TUG1可通過負(fù)調(diào)節(jié)miR-1294的表達(dá),促進(jìn)食管癌細(xì)胞的凋亡。最新的研究[14]表明,miR-1294不僅能抑制ESCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲,還可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G0/G1期,發(fā)揮抑癌作用。本研究中雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示miR-1294和circPDE3B有靶向關(guān)系,抑制miR-1294可以部分逆轉(zhuǎn)敲低circPDE3B導(dǎo)致的ESCC細(xì)胞增殖受抑,克隆形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)減少,劃痕愈合率降低。

總之,ESCC中circPDE3B表達(dá)上調(diào),circPDE3B可能通過miR-1294影響ESCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。