一種新型比率熒光毛細管pH 傳感器的制備及性能

許盼英， 李天依， 王小卉*， 黎 喆， 王貴生

（1.北京郵電大學 電子工程學院， 安全生產智能監控北京市重點實驗室， 北京 100876；2.解放軍總醫院第三醫學中心 放射診斷科， 北京 100039）

1 引 言

酸堿度是生物醫學、臨床分析、食品安全和環境工程等領域的重要測量參數，對其進行準確、快捷的測定在實際應用中尤為重要[1-3]。目前基于熒光分析方法的生物檢測技術因為響應速度快、空間分辨率高、操作簡單等優點常被應用于pH 檢測[4-6]。熒光pH 傳感器通常由對pH 敏感的熒光探針、載體薄膜和固定基質組成。在檢測過程中，待測分析物透過薄膜與熒光傳感探針發生相互作用，通過分析熒光探針光學信號變化來檢測pH 變化[7-9]。目前常用的pH 熒光探針主要有熒光素及其衍生物[10-11]、萘酰亞胺類衍生物[12]和1-羥基-3，6, 8-芘三磺酸（HPTS）[13-15]等。其中，HPTS 是一種應用廣泛的水溶性pH 指示劑染料，水溶液中pKa 約為7.3，具有綠光波段發射，且擁有兩種具有不同pH 依賴性的激發帶[13]，分別對應于質子化（酸性，405 nm 左右）模式及去質子化（堿性，460 nm 左右）模式，這兩種激發帶有利于進行比率熒光測量。目前，將pH 敏感的熒光探針與納米材料、有機物膜、光纖等基質結合制作的熒光傳感器得到了廣泛的關注[16-17]。石英毛細管在材料方面與光纖具有結構一致性，由中空部分和石英管壁等組成，常被用于制作整體結構簡單、穩定性好、靈敏度高的傳感器件[18-20]。此外，石英毛細管可同時實現液體傳輸和光線傳輸雙重功能，其不僅可有效減少樣品的用量，而且因將熒光探針分子固定于毛細管的內壁，在管壁的保護下性能更穩定。近年來利用毛細管作為固定基質的熒光pH 傳感器逐漸應用于酸堿度監測[21]，然而，基于單一熒光強度的檢測方式常受到探針濃度、激發光強度和探測器波動等因素影響。引入參比熒光的比率檢測方法可避免各種外部因素對測試數據的影響，進而有效提高檢測精度[15,22-23]。但是，目前圍繞比率型熒光毛細管傳感器的pH 檢測工作尚未見報道，因此亟需發展精準穩定的比率熒光毛細管pH 傳感器以便開展方便靈活的pH 監測分析。

本文利用溶膠-凝膠法制備了以HPTS 作為熒光探針的石英毛細管比率pH 傳感器。首先將HPTS 與CTAB 結合形成HPTS-IP 離子對，然后將其均勻分散于ETEOS 和GPTMS 的溶膠混合樣品中，并將其涂抹于毛細管內壁，加熱干燥后在毛細管內壁成功固定包覆HPTS 的溶膠-凝膠薄膜，即制得比率熒光毛細管pH 傳感器。HPTS 在405 nm 和460 nm 分別激發下的熒光信號具有不同的pH 響應，二者的熒光強度比率具有較強的pH 敏感性，根據毛細管傳感器的比率熒光信號變化可有效檢測pH 值變化，進而在生物醫學和環境保護領域的pH 監測與分析方面具有巨大潛力。

2 實 驗

2.1 試劑與儀器

試劑：8-羥基芘-1,3,6-三磺酸三鈉鹽（HPTS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、乙基三乙氧基硅烷（ETEOS）、（3-縮水甘油氧丙基）三甲氧基硅烷（GPTMS）和1-甲基咪唑（MI）購自麥克林化學試劑有限公司。無水乙醇和鹽酸購自國藥集團化學試劑有限公司。在實驗過程中均使用去離子水，所有化學試劑未進行處理。

儀器：利用Hitachi S-4800 掃描電子顯微鏡表征毛細管內壁薄膜形貌（SEM），通過Hitachi F-4600 熒光分光光度計測試比率熒光毛細管傳感器的激發和發射光譜。

2.2 負載pH 敏感薄膜的毛細管傳感器制備方法與步驟

第一步合成HPTS-IP 離子對，在50 ℃條件下，將0.76 mmol 的CTAB 溶解在25 mL 的去離子水中，隨 后，將0.38 mmol HPTS 溶解在25 mL 去離子水中，并加入到CTAB 溶液中合成離子對。然后將離子對沉淀（HPTS-IP）過濾并在烘箱中干燥，并將樣品溶于乙醇中備用。第二步制備基于ETEOS 的溶膠，將ETEOS、0.1 mol·L-1鹽酸水溶液和乙醇按1∶0.007∶6.25 的量比混合。第三步制備基于GPTMS 的溶膠，以GPTMS、MI、去離子水和乙醇為原料，配制1∶0.69∶4∶6.25 量比混合溶液。最后將上述第二步和第三步的兩種溶膠以等量比混合后，與HPTS-IP 乙醇溶液以1 000∶1 的溶膠染料比混合，攪拌均勻后涂抹于毛細管內壁，在140 ℃條件下加熱4 h，即制得負載pH 敏感薄膜的毛細管傳感器。

3 結果與討論

3.1 比率熒光毛細管pH 傳感器的構建和表征

基于HPTS 的比率熒光毛細管pH 傳感器通過溶膠-凝膠法制備[13,21,24]，將基于ETEOS 和基于GPTMS 的兩種溶膠與HPTS-IP 混合后涂抹于毛細管內壁，干燥后在毛細管內壁成功負載pH 敏感的溶膠-凝膠薄膜，即制得比率熒光毛細管pH 傳感器。由于HPTS-IP 離子對疏水性強于HPTS，因此可減少HPTS 在待測液中的浸出。

比率熒光毛細管pH 傳感器示意圖和實物照片如圖1（a）所示，黃綠色部分為固定于毛細管內壁的負載HPTS 染料的溶膠-凝膠薄膜，該薄膜無明顯的裂縫，厚度較為均勻。通過掃描電鏡對毛細管傳感膜的剖面進行成像（圖1（b）黃色標框區域），結果表明該傳感膜表面致密、光滑且比較均勻。HPTS 的激發光譜如圖2（a）中虛線所示，其擁有兩種具有不同pH 依賴性的激發帶[13]，分別位于405 nm 左右和460 nm 左右。HPTS 的發射光譜如圖2（a）中實線所示，其僅擁有單個發射帶，在513 nm 左右具有較強的發射峰。當環境pH 值由5 上 升 至8 時，460 nm 和405 nm 左 右 的 激 發 峰 位置未發生明顯變化（圖2（b）），在405 nm 和460 nm光激發下，傳感器的發射光譜峰值位置未發生變化（圖2（c））。HPTS 的雙激發峰為基于參比激發模式的比率熒光pH 檢測提供了條件。利用該傳感器進行pH 檢測時，待測溶液可與毛細管內壁的傳感膜充分發生反應，并最終通過光譜儀檢測到熒光信號變化，根據熒光信號可有效地分析pH 值變化。

圖1 （a）比率熒光毛細管pH 傳感器的結構示意圖，右上角插圖為實物照片；（b）pH 傳感膜的SEM 圖像，標尺20 μmFig.1 （a）Schematic illustration of ratiometric fluorescent capillary sensor.The inset is photo image.（b）SEM image of pH sensing film， scale bar： 20 μm

圖2 （a）HPTS 的激發光譜（虛線，λem =513 nm）和發射光譜（實線，λex=460 nm）；（b）pH 為5 和8 時，比率熒光毛細管傳感器的激發光譜（λem=513 nm）；（c）在405 nm 和460 nm 光激發下，傳感器的發射光譜Fig.2 （a）Excitation spectra（dashed lines，λem=513 nm）and emission spectra（solid lines，λex=460 nm） of HPTS loaded on the capillary sensor.（b）Excitation spectra of capillary sensor in different pH concentrations（λem =513 nm）.（c）Emission spectra of capillary sensor under excitation at 405 nm and 460 nm

3.2 比率熒光毛細管傳感器的pH 敏感性

為分析比率熒光毛細管傳感器的pH 敏感特性，我們利用熒光光譜儀依次表征該毛細管傳 感 器 在pH 值 為5.0，6.0，6.6，7.0，7.4，8.0的緩沖溶液中的發射光譜變化。在405 nm 激發光作用下，該毛細管傳感器的發射光譜如圖3（a）所示。當緩沖溶液的pH 由5.0 上升至7.0時，傳感器的熒光發射強度隨環境pH 值的上升而逐漸升高；當pH 從7.0 上升至 8.0 時，熒光強度又略微下降，可能是由于激光輻照時間增加影響光穩定性所致。在460 nm 激發光作用下，該毛細管傳感器的發射光譜如圖3（b）所示。隨著緩沖溶液的pH 由5.0 上升至7.0，傳感器的熒光發射強度逐漸升高；而當pH 從7.0 上升至8.0 時，熒光強度則略微下降，該現象也歸因于激光輻照時間增加影響熒光探針的發光強度。取圖3（a）和圖3（b）在513 nm 處的發光強度之比進行比率熒光分析（圖4），發現從pH=5.0 上升至pH=8.0 時，比率熒光強度大約升高2.6 倍。將比率熒光信號與不同pH 進行Sigmoidal 曲 線 擬 合[25]，pKa 值 為6.95，擬 合 度（R2）為0.99。以上實驗結果表明，該比率熒光毛細管傳感器具有較好的pH 敏感性，可有效避免單一熒光強度檢測所受的長時間激光輻照影響，基于HPTS 在雙激發帶下的發射強度比值變化可實現對pH 的靈敏檢測。

圖3 在405 nm（a）和460 nm（b）光激發下，比率熒光毛細管傳感器在不同pH 值環境中的發射光譜Fig.3 Emission spectra of capillary sensor in different pH concentrations under excitation at 405 nm（a） and 460 nm（b）

圖4 圖3（b）與3（a）中513 nm 處熒光強度的比率在不同pH 環境下的響應擬合曲線Fig.4 Sigmoidal fitting plot of fluorescence intensity ratios of Fig.3（b） and Fig.3（a） at 513 nm

3.3 比率熒光毛細管傳感器的穩定性和可逆性

傳感器件的良好穩定性是實際應用的基本要求。為分析比率熒光毛細管pH 傳感器的穩定性，我們將制得的毛細管傳感器在避光的條件下儲存，分別在第0，2，4，6，8，10，40，42，44，46 d 監測其熒光發射光譜變化。圖5（a）是取不同儲存時間發射光譜的比率熒光信號繪制的時間-比率熒光強度相關曲線，圖中表明該傳感器的比率熒光強度隨時間延長未發生明顯改變，在儲存46 d 后依然具有較穩定的比率熒光信號，證明該傳感器具有較好的穩定性。此外，我們進一步分析了比率熒光傳感器在水溶液中的穩定性（圖5（b））和在光源輻照下的穩定性（圖5（c））。如圖5（b）所示，在75 min 時間內，比率信號未發生明顯變化，證明該傳感器在水溶液中具有較好的穩定性。如圖5（c）所示，在光源輻照90 min 后，比率熒光信號幾乎不變，證明該傳感器在光源輻照下具有較好的穩定性。該傳感器良好的穩定性能主要取決于熒光染料HPTS-IP 離子對與溶膠-凝膠基質的共價結合、石英毛細管較好的固定作用以及比率熒光的檢測方式。

圖5 比率熒光毛細管pH 傳感器的穩定性研究。 （a）貯存46 d 后的穩定性；（b）在水溶液中貯存75 min 后的穩定性；（c）光源輻照后的穩定性Fig.5 Stability of ratiometric fluorescent capillary sensor stored for 46 d（a）， stored in aqueous solution for 75 min（b） and after irradiation by 460 nm light（c）

傳感器的可逆性是可重復監測的重要依據。為分析該比率熒光毛細管pH 傳感器的可逆性，將毛細管傳感器多次交替放入pH=5.0 和pH=8.0 的緩沖溶液中，然后測試該傳感器的比率熒光信號強度變化。如圖6 所示，取513 nm處的熒光發射強度比值，分析其隨測量環境pH改變的波動情況。當環境pH 在5.0 和8.0 之間交替變化時，傳感器的比率熒光強度具有較好的可重復性。實驗結果表明，該比率熒光毛細管pH 傳感器擁有良好的可逆性，便于多次重復進行pH 監測。

圖6 毛細管傳感器比率熒光信號對pH 響應的可逆性Fig.6 Reversibility of the responsiveness of capillary sensor to pH changes

4 結 論

本文通過溶膠-凝膠法制備了一種比率熒光毛細管pH 傳感器，該傳感器以HPTS 作為pH 敏感的熒光探針，在毛細管內壁固定含有HPTS 的溶膠-凝膠薄膜。該傳感器在460 nm 和405 nm 激發光分別作用下的熒光發射峰強度比值具有較高的pH 靈敏度，當pH 從5.0 升至8.0 時，比率熒光信號增強大約2.6 倍，pKa 值為6.95。該比率熒光毛細管pH 傳感器具有良好的穩定性、高的pH敏感性、較好的可逆性和便攜性，在環境科學和生物醫學領域的pH 監測分析方面擁有廣泛的應用前景。

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