基于生物信息學篩選肺動脈高壓關鍵基因及驗證

【摘要】 目的 通過生物信息學分析，從基因表達數據庫（GEO）數據集中篩選出肺動脈高壓（PAH）的關鍵基因，并探索其潛在的生物學功能和信號通路。

方法 下載GSE15197數據集，利用GEO2R識別差異表達基因（DEGs），通過加權基因共表達網絡分析（WGCNA）識別與PAH相關性最大的模塊，采用Venn圖鑒別共表達的交集基因，對交集基因進行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集通路分析，構建蛋白質相互作用網絡（PPI），利用Cytosccape進行可視化并識別關鍵基因。

結果 共識別出1677個DEGs，鑒定出198個交集基因，利用Cytosccape篩選出10個得分最高的關鍵基因。RT-PCR結果顯示，CHUK、ANK2、PPP2CA在PAH患者外周血單核細胞和MCT誘導的PAH大鼠肺泡巨噬細胞中的mRNA表達量增高。

結論 通過生物信息學分析篩選出與PAH相關的關鍵基因，為PAH的防治提供可靠的生物標志物。

【關鍵詞】 肺動脈高壓；生物信息學；CHUK；ANK2；PPP2CA

中圖分類號：R543.2"" 文獻標志碼：A"" DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2024.12.002

Screening and verification of key genes for pulmonary

arterial hypertension based on bioinformatics

[HJ1*2][HJ]

LI Lixiang， CHEN Xing， LIANG Limei， DENG Yan

（Ultrasound Department， the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Nanning 530022， Guangxi， China）

[HJ2][HJ]

【Abstract】 Objective To screen key genes of pulmonary arterial hypertension （PAH） from the dataset of gene expression omnibus （GEO）， and to explore their potential biological functions and signaling pathways through bioinformatics analysis.

Methods GSE15197 dataset was downloaded， GEO2R was used to identify differentially expressed genes （DEGs）， and weighted correlation network analysis （WGCNA） was used to identify module with the highest correlation with PAH. Venn diagram was used to identify co-expressed intersecting genes， perform gene ontology （GO） and Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） enrichment pathway analysis on intersecting genes， and construct protein-protein interaction（PPI）. In addition， key genes were visualized and identified by Cytosccape.

Results A total of 1677 DEGs were identified， 198 intersecting genes were identified， and 10 key genes with the highest scores were screened by Cytoscape. RT-PCR results showed that the mRNA expression levels of CHUK， ANK2， and PPP2CA increased in the peripheral blood mononuclear cells of PAH patients and pulmonary alveolar macrophages induced by MCT in PH rats.

Conclusion Screening key genes related to PAH through bioinformatics analysis can provide reliable biomarkers for the prevention and treatment of PAH.

【Keywords】 pulmonary arterial hypertension （PAH）; bioinformatics; CHUK; ANK2; PPP2CA

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一類復雜的病理生理綜合征，特征為血管重構和管腔狹窄，導致肺血管阻力和肺動脈壓力逐漸升高，最終可能引發右心衰竭甚至死亡，因此被視為一種高致死率的心血管疾病［1-2］。目前，PAH的治療主要集中在三大通路：內皮素通路、前列環素通路和一氧化氮（NO）通路［3-4］。雖然這些治療方法可以緩解患者的臨床癥狀并改善血流動力學，但未能有效抑制肺血管重構，無法從根本上阻止PAH的進展，進而影響其預后［5］。因此，尋找新的潛在生物干預靶點對抑制PAH的發生和發展具有重要意義。PAH的發病機制復雜，涉及多種因素和病理生理過程，包括免疫反應的異常。免疫炎癥因素在PAH的形成及血管重構過程中發揮著關鍵作用［6］。肺血管周圍的炎癥反應先于血管重構的發生，這表明免疫改變是導致血管疾病的原因，而非結果［7］。巨噬細胞作為PAH病變周圍浸潤的主要炎癥細胞，在PAH肺血管重構加劇中發揮著至關重要的作用［8］。PAH患者及其動物模型的肺組織中，巨噬細胞的數量顯著高于正常對照組［9］。此外，在PAH患者和動物模型中，肺部的單核細胞募集趨化因子水平升高，外周血單核細胞的數量也增加［9］。在遷移到肺血管系統后，單核細胞有可能分化為血管周圍巨噬細胞，并參與肺部的炎癥反應。

隨著基因微矩陣技術的快速發展，基因表達數據庫（GEO）已被廣泛用于尋找復雜疾病的潛在生物標志物，以及識別可能的致病基因［10］。近年來，生物信息學在分析PAH患者或實驗動物的肺組織或細胞中的基因表達方面得到了廣泛應用。這一領域的研究鑒定出了幾種具有治療作用的基因靶點，并為其發病機制提供了新的認識［11-13］。本研究基于數據挖掘和生物信息學平臺分析，利用GEO數據庫中的基因表達數據，通過GEO2R工具篩選PAH患者與健康對照組之間的差異表達基因（DEGs）。接著，采用加權基因共表達網絡分析（WGCNA）和富集通路分析，進一步探索潛在的PAH治療靶點和生物學功能，并通過體外實驗進行驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

10只體重在230～260 g的SD雄性大鼠，隨機分為對照組和模型組。模型組接受MCT（60 mg/kg）單次腹腔注射，對照組則給予等量溶劑。所有大鼠在適宜的溫度和濕度條件下飼養，且可自由獲取食物和水，持續28天。

1.2 實驗試劑

MCT（MCE公司），IMDM培養基（Gibco公司），胎牛血清（維森特），人外周血單核細胞分離液試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），RNA抽提試劑盒（上海碧云天生物技術股份有限公司），逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司），PCR試劑盒（TaKaRa公司）。

1.3 數據庫及外周人血標本

通過GEO數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲取微陣列數據集GSE15197，包括26名PAH患者和13名正常對照的肺組織標本。本研究納入了廣西醫科大學第一附屬醫院的PAH患者，年齡均≥18歲，且經右心導管確認靜息平均肺動脈壓（mPAP）≥25 mmHg。所有方法均按照相關指南執行。本研究已獲得廣西醫科大學第一附屬醫院倫理委員會的倫理審查（審批編號：2024-S251-01），所有受試者均簽署了知情同意書，所有研究程序符合《赫爾辛基宣言》。本研究的工作流程如圖1所示。

1.4 方法

1.4.1 大鼠肺泡巨噬細胞分離培養

采用SD大鼠頸椎脫臼法處死，隨后進行固定、備皮和消毒，充分暴露胸腔，分離肺組織并放入含雙抗的PBS中。在超凈臺內，將軟管插入氣管，并用細線將氣管與軟管綁緊，連接注射器，使用PBS對肺組織進行灌洗，反復抽吸數次。收集肺泡灌洗液，并在4 ℃下以1000 rpm離心5分鐘。棄去上清液，加入2 mL紅細胞裂解液，輕輕混勻后靜置5分鐘，隨后加入6 mL PBS，繼續在4 ℃下以1000 rpm離心5分鐘，棄去上清，最后將細胞重懸于IMDM中并混勻。

1.4.2 人外周血單核細胞分離

將新鮮抗凝全血用PBS稀釋，在離心管中加入適量的分離液，將稀釋后的血液平鋪到分離液的液面上方，在室溫下以1000 g離心30分鐘。吸取離心后的白膜層到15 mL離心管中，加入10 mL PBS，在室溫下以250 g離心10分鐘。棄去上清液，再加入5 mL PBS重懸，室溫下以250 g離心10分鐘，棄去上清液后，將細胞重懸備用。

1.4.3 篩選DEGs

利用GEO數據平臺的GEO2R進行特發性肺動脈高壓與對照組肺組織標本的差異表達分析。設定P值小于0.05，log2FC絕對值大于1為標準，鑒定出DEGs，并繪制DEGs火山圖。根據基因芯片標注信息，將探針名稱修改為對應的基因名稱，去除沒有基因標注的探針。此外，對屬于同一基因的多個探針的表達值計算平均值。

1.4.4 加權基因共表達網絡分析

WGCNA是一種探索基因網絡與疾病之間關系的算法，可用于識別基因與微矩陣樣本之間的相關性，能夠發現具有較高生物學意義的共表達基因模塊［14-15］。本研究使用WGCNA軟件包構建數據集GSE15197的基因共表達網絡。首先，計算基因之間的相關系數，并利用相關系數的加權值在無標度網絡中連接基因；其次，根據基因間的相關系數構建層次聚類樹，樹形圖的不同分支代表不同的基因，而不同的顏色代表不同的模塊。再次，計算模塊顯著性（MS），以衡量性狀與不同模塊的相關性，并記錄各模塊中的基因。通過基因顯著性（GS）分析樣品性狀與基因的相關性，選取相關性最強的模塊，并在散點圖中顯示GS值和模塊隸屬度（MM）值。最后，探討每個模塊與PAH或對照之間的相關性，與PAH相關性最大的模塊被認為是進一步分析的關鍵模塊。

1.4.5 功能和通路富集分析

DEGs與WGCNA獲得的共表達模塊中顯著性最大的部分制作Venn圖，提取交集基因供后續分析。使用基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）對交集基因進行功能富集分析［16］。GO注釋包括分子功能（MF）、細胞成分（CC）和生物過程（BP）三大類，結果以-Log10（P）表示，顏色梯度代表調整后的P值，并使用條形圖顯示每個GO類別的前10個富集項目。此外，對交集基因進行KEGG分析，結果同樣以-Log10（P）表示。

1.4.6 構建蛋白互作網

通過STRING （https：//string-db.org/）構建交集基因的蛋白質相互作用網絡（PPI），研究交集基因的潛在相互作用并實現可視化。在PPI中，節點和邊表示蛋白質間的相互作用關系［17］。

1.4.7 Cytoscape識別關鍵基因

利用Cytoscape進一步可視化PPI網絡，邊和節點代表相互作用。相互作用最多的節點被視為中心基因。使用插件Cytohubba，以最大團中心度（MCC）算法的前10名為標準，篩選出得分最高的樞紐基因。

1.4.8 關鍵基因實時熒光定量PCR檢測

通過RT-PCR檢測篩選出的關鍵基因的mRNA表達水平。使用碧云天RNA抽提試劑盒制備大鼠肺泡巨噬細胞和人外周血單核細胞的總RNA樣品，并檢測RNA的濃度和純度。隨后，根據說明書將總RNA轉化為cDNA。采用實時熒光定量PCR （RT-qPCR）對基因表達進行定量，檢測時使用SYBR Green Mix （TaKaRa， Japan），β-actin作為內參。相對表達水平通過2-ΔΔCt法確定。所用引物序列見表1。

1.4.9 統計學方法

使用SPSS 22.0進行統計分析。計量資料符合正態分布，以均數±標準差（±s）表示，使用GraphPad Prism 8繪制柱狀圖。組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2 結" 果

2.1 鑒定PAH患者與對照組DEGs

利用GEO數據庫平臺的GEO2R在數據集GSE15197中共鑒定出1677個DEGs，其中752個上調基因，925個下調基因。DEGs火山分布圖如圖2A所示。前20個DEGs的熱圖如圖2B所示。

2.2 WGCNA

通過WGCNA，建立了13個共表達模塊，如圖3所示，每種顏色代表一個不同的模塊。利用Pearson相關分析評價各模塊與性狀之間的關系，評估各模塊與PAH的相關性。鑒定出三個相關性最強的模塊：黑色模塊（R=-0.66，P=7e-05）、藍色模塊（R=-0.70，P=1e-05）和綠色模塊（R=0.67，P=6e-05），結果顯示綠色模塊與PAH呈正相關，黑色模塊和藍色模塊與PAH呈負相關（圖3）。黑色模塊中有202個基因，藍色模塊中有1631個基因，綠色模塊中有474個基因，綠色模塊用于后續分析。

2.3 交集基因的GO和KEGG富集分析

DEGs與WGCNA中綠色模塊的Veen圖共獲得198個交集基因（圖4A），對交集基因進行GO和KEGG通路分析，GO分析顯示，交集基因主要集中在細胞增殖、血管生成和信號轉導等生物學過程，富集在染色質、突觸和肌動細胞骨架等細胞組分，富集在蛋白質結合、DNA結合等分子功能（圖4B-D）。KEGG顯示交集基因主要富集在FOXO信號通路、ErbB信號通路、小細胞肺癌、NF-κB信號通路和PI3K-Akt信號通路（圖4E）。

2.4 PPI的構建和模塊分析

為了研究交集基因的潛在相互作用，我們進行了PPI分析。在STRING上傳篩選出的198個交集基因，建立PPI網絡實現可視化。PPI網絡包括68個節點和91條邊（圖5A）。

2.5 識別關鍵基因

將PPI網絡數據導入Cytoscape軟件以鑒定中心樞紐基因，利用Cytoscape中的Cytohubba插件，通過MCC算法推測樞紐基因，明確了得分最高的前10個重要的關鍵基因，分別為EP300、KMT2A、CHUK、CDKN1B、BRD3、CHD6、DDX6、ANK2、XIAP、PPP2CA（圖5B）。與對照組相比，PAH患者中CHUK、ANK2和PPP2CA基因明顯上調表達（表2）。此外，ROC曲線顯示，這3個關鍵基因的AUC值分別為0.914、0.888、0.950，AUC值較高（圖6A-C），可以作為PAH的獨立指標。

2.6 關鍵基因RT-PCR驗證

通過對GSE15197數據集的分析，發現CHUK、ANK2、PPP2CA在PAH患者的肺組織中表現出上調。基于這個發現，我們選擇采用RT-PCR進行進一步體外實驗驗證。結果顯示，CHUK、ANK2、PPP2CA在PAH患者外周血單核細胞中的mRNA表達量高于健康對照組，這一結果與生物信息學分析一致，同樣在PAH大鼠的肺泡巨噬細胞中我們也觀察到這一結果（圖7A-F）。

3 討" 論

PAH是一種由多種因素引起的嚴重心肺疾病，其特征是肺血管阻力逐漸增加，最終導致右心衰竭甚至死亡［18］。巨噬細胞在肺血管周圍的聚集是PAH發生肺血管重構的重要標志［19］。在病理狀態下，單核細胞可被招募至肺組織，并分化為巨噬細胞，這也是PAH肺血管重構的重要原因［20］。巨噬細胞通過釋放炎性因子如IL-1β和IL-18，對肺動脈內皮細胞（PAEC）造成損傷，從而介導肺動脈平滑肌細胞（PASMC）的增殖和遷移，影響PAH的發生與發展［21］。在本研究中，共鑒定出1677個DEGs，并結合WGCNA確定了與PAH相關的共表達模塊，篩選出了198個交集基因。GO和KEGG通路分析顯示，這些基因主要參與細胞增殖、血管生成和信號轉導等生物學過程。進一步通過PPI分析和Cytoscape軟件篩選出CHUK、ANK2、PPP2CA等10個關鍵基因，并通過RT-PCR實驗驗證了這些基因在PAH患者的外周血單核細胞和PAH大鼠模型肺巨噬細胞中的mRNA表達水平顯著升高。

CHUK（也稱為IKKα）是IKK復合體的一個關鍵組成部分， 在調節NF-κB信號通路中起著至關重要的作用［22］。IKK/NF-κB信號通路是促炎反應的關鍵元素［23］。通過抑制IKK/NF-κB信號通路可以減輕LPS誘導的炎癥［24］和肺部損傷［25］。此外，降低IKK/NF-κB信號通路活性可以改善LPS誘導的炎性痛覺過敏［26］。一項對淋巴瘤的研究發現，CHUK過表達促進了淋巴瘤細胞的增殖并抑制了細胞凋亡［27］。ANK2基因編碼的蛋白質稱為ankyrin-B（ANKB），是一種大型骨架蛋白，在心臟和神經細胞中扮演著重要角色［28］。ANK2的功能障礙與一系列心臟和神經疾病有關，包括心律失常、心臟結構異常、癲癇和自閉癥譜系障礙（ASD）。盡管目前關于ANK2在免疫細胞中直接作用的研究較少，但其在細胞骨架結構和信號傳導中起著關鍵作用。細胞骨架在細胞運動和免疫細胞的功能中發揮著重要作用［29］，因此ANK2可能通過間接途徑在炎癥反應中起到調節作用。一項研究探討了肺腺癌中ANK2表達與抗腫瘤免疫的相關性［30］，發現ANK2突變的肺腺癌患者可能具有增強的腫瘤免疫原性，這可能通過癌癥－免疫循環來促進。

PPP2CA是PP2A復合體中的主要催化亞基。研究發現，靶向PPP2CA可以誘導巨噬細胞M2極化［31］。在乳腺癌中，PPP2CA的下調增強了NF-κB信號傳導，并促進了巨噬細胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達［32］。此外，PPP2CA的表達負性調控肥大性反應，PPP2CA轉基因小鼠受到保護，免受異丙腎上腺素誘導的心臟肥大和心臟纖維化損害［33］。據報道，PPP2CA編碼的PP2A可能參與調節巨噬細胞中的炎癥通路［34］，并影響巨噬細胞的M1極化，促進小鼠肺損傷［35］。有研究指出，黃連素通過PP2A信號通路在體內和體外均可降低肺動脈高壓［36］。PP2A的活化可減輕急性肺損傷小鼠模型的炎癥反應［37］。PP2A活性的增強還可以預防小鼠的慢性煙霧誘發的慢性阻塞性肺疾病（COPD）［38］。在小鼠痛風模型中，PP2A還調節炎癥單核細胞的內流［34］。驗證這些基因在PAH中的表達為下一步探索PAH潛在生物標志物提供了可能的基因靶點，并為開發新的治療策略提供了參考。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2024-10-12 修回日期：2024-11-13）

（編輯：梁明佩）

基金項目：國家自然科學基金（82060051，82460082）；廣西自然科學基金（2023GXNSFAA026173）

第一作者簡介：李麗香，女，在讀碩士研究生，研究方向：肺動脈高壓。E-mail：1900023147@qq.com

通信作者：鄧燕。E-mail：qqrwbyb@163.com

［本文引用格式］李麗香，陳幸，梁麗媚，等.基于生物信息學篩選肺動脈高壓關鍵基因及驗證［J］.右江醫學，2024，52（12）：1062-1070.