支氣管哮喘患兒外周血miR-30a、miR-15b-5p水平與氣道炎癥、肺功能的關系

崔云會

河南省商丘市第一人民醫院分子生物實驗室 476000

支氣管哮喘作為威脅全球范圍內的一種嚴重公眾健康慢性呼吸道疾病,目前以兒童發病率最高,根據流行病學調查發現,兒童哮喘患病率為3.3%～29.0%,且患病率總體上仍在上升[1]。雖目前關于該疾病具體發病機制尚未完全闡明,但氣道炎癥在支氣管哮喘發病中起關鍵作用[2]。MicroRNA作為調節基因表達的單鏈非編碼小分子RNA,目前研究發現其參與多種信號通路的調節[3]。近年來已有研究發現miRNA與哮喘氣道炎癥關系密切,其可通過基因水平調控哮喘發生發展[4]。既往有研究顯示,血清miR-30a與極低體重兒支氣管肺發育不良相關[5]。同時有研究發現,miR-15b-5p可作為哮喘—慢性阻塞性肺病重疊的生物標志物[6]。但目前研究關于外周血miR-30a、miR-15b-5p與支氣管哮喘患兒的關系尚不清楚。因此,本研究擬分析支氣管哮喘患兒外周血miR-30a、miR-15b-5p水平與氣道炎癥、肺功能的關系,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2020年3月—2022年3月我院收治的123例支氣管哮喘患兒納入研究組,其中男66例,女57例,年齡2～14歲,平均年齡(7.85±1.22)歲。(1)納入標準:①符合支氣管哮喘診斷標準[7];②均簽署知情同意書;③年齡2～15歲者。(2)排除標準:①伴有重要臟器功能不全者;②合并感染性疾病、心血管疾病、急慢性感染疾病以及惡性腫瘤疾病者;③既往伴有哮喘病史、其他過敏性疾病家族史及其他免疫性疾病者;④近期存在免疫抑制劑、糖皮質激素等治療史者;⑤近期上呼吸道感染史者;⑥臨床資料不全者;⑦不配合治療、中途退出研究者。另外選擇同期在我院體檢的100例健康兒童作為對照組,其中男60例,女40例,年齡3～15歲,平均年齡(8.10±1.52)歲。本研究經我院倫理委員會審核批準。

1.2 方法 (1)外周血miR-30a、miR-15b-5p檢測:獲得本研究納入對象同意后,抽取入院24h內的空腹外周靜脈血5ml送檢,室溫下以3 500r/min離心15min后取清液,存放至-80℃冰箱內備用。取出血清樣本后按照比例加入提取試劑Trizol后充分搖勻,隨后參照miRNA試劑盒提取血清總miRNA。再使用RNA逆轉錄盒合成cDNA,反應體系15μl,逆轉錄反應條件:37℃15min,85℃5s。利用分光光度計檢測cDNA濃度,將cDNA稀釋后取2μl作為模板,采用7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)檢測,并以U6作為內參照。PCR儀器設置參數為95℃、5min、40個循環,95℃、10s、40個循環,90℃、1min、40個循環;miR-30a引物,正向:5’-CATGGGTTGTCTCAGTGTCAGAGCT-3’,反向:5’-TGCCTTCTGTCTCCAGTCTTCCAA-3’,引物長度235bp;miR-15b-5p引物,正向:5’-GAGGATGATTGCTGACGTGGA-3’,反向:5’-TCTCAGATGGTGAGCGAG-3’,引物長度176bp。最后采用CFXmanager3.0軟件對Cq值進行分析,再通過2-Δt法(Δt=CTmiRNA-CTU6)計算血清miR-30a、miR-15b-5p的相對表達量。本研究所有試劑盒均由博士德生物有限公司生產。(2)氣道炎性細胞檢測:獲得本研究納入對象同意后收集咳出痰液送檢,觀察記錄各組細胞總數、中性粒細胞、嗜酸粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞數目。(3)肺功能指標檢測:由受過專業培訓的實驗者采用MasterScreen肺功能檢測儀測定所有受試者用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼氣量(FEV1%)、第1秒用力呼氣量占用力肺活量百分比(FEV1/FVC)等肺功能指標,每位受試者均測定2次,最終結果取平均值。

2 結果

2.1 兩組外周血miR-30a、miR-15b-5p水平比較 研究組患兒外周血miR-30a、miR-15b-5p水平均高于對照組(P<0.05),見表1。

表1 兩組外周血miR-30a、miR-15b-5p水平比較

2.2 兩組氣道炎性細胞檢測比較 研究組患兒誘導痰中的細胞總數、中性粒細胞、嗜酸粒細胞、淋巴細胞的數目均高于對照組(P<0.05),巨噬細胞的數目低于對照組(P<0.05),見表2。

表2 兩組氣道炎性細胞檢測比較

2.3 兩組肺功能指標比較 研究組患兒FEV1、FVC、FEV1/FVC肺功能指標均低于對照組(P<0.05),見表3。

表3 兩組肺功能指標比較

2.4 支氣管哮喘患兒外周血miR-30a、miR-15b-5p與氣道炎癥、肺功能的相關性 Pearson相關分析顯示,支氣管哮喘患兒外周血miR-30a、miR-15b-5p水

平均與肺功能指標(FEV1、FVC、FEV1/FVC)及巨噬細胞呈負相關(P<0.05),與細胞總數、中性粒細胞、嗜酸粒細胞、淋巴細胞數目呈正相關(P<0.05),見表4。

2.5 外周血miR-30a、miR-15b-5p對小兒支氣管哮喘的預測價值 ROC曲線分析顯示,外周血miR-30a、miR-15b-5p預測小兒支氣管哮喘發生的曲線下面積為0.841(95%CI:0.792～0.890)、0.862(95%CI:0.817～0.917),二者聯合預測小兒支氣管哮喘發生的曲線下面積為0.911(95%CI:0.874～0.958),見表5、圖1。

圖1 外周血miR-30a、miR-15b-5p對小兒支氣管哮喘的預測ROC曲線

表5 外周血miR-30a、miR-15b-5p對小兒支氣管哮喘的預測價值

3 討論

miRNA作為由21～25個核苷酸組成,有著超強的穩定性的非編碼單鏈RNA分子,參與細胞分化、基因調控、腫瘤發生等多種生物學功能,目前已經被公認為是生物體內的重要調控分子[8-9]。既往研究發現miRNA中的miR-145-5p、RNAmiR-21等均可通過介導炎癥反應等影響支氣管哮喘的病理生理過程[10-11]。而miR-30a、miR-15b-5p雖也作為miRNA成員之一,但李智慧等[12]miR-30a通過靶向調控E盒結合鋅指蛋白2抑制非小細胞肺癌的遷移與侵襲;但叢鵬等[13]研究顯示,肝細胞癌患者血清miR-30a表達水平低于正常人群。Ma等[14]研究發現,miR-15b-5p可抑制STAT3表達從而減輕2型糖尿病相關肺結核小鼠的肺損傷;Salimi等[15]研究顯示,miR-15b-5p在外界毒物致肺損傷過程中明顯升高。

本研究分析外周血miR-30a、miR-15b-5p水平在支氣管哮喘患兒中發現,研究組患兒外周血miR-30a、miR-15b-5p水平均高于對照組(P<0.05),提示外周血miR-30a、miR-15b-5p水平可能參與支氣管哮喘的發生,與以上某些研究結論一致。嗜酸粒細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞都是目前常見的炎癥細胞,而本次研究分析結果顯示,研究組患兒誘導痰中的細胞總數、中性粒細胞、嗜酸粒細胞、淋巴細胞的數目均高于對照組,巨噬細胞的數目低于對照組(P<0.05),說明支氣管哮喘患兒誘導痰液中的炎癥細胞數目顯著增多,進一步提示患兒氣道存在明顯的炎癥反應。

同時本研究結果顯示,研究組患兒FEV1、FVC、FEV1/FVC肺功能指標均低于對照組(P<0.05),說明支氣管哮喘患兒存在肺部氣流受限。本研究相關分析顯示,支氣管哮喘患兒外周血miR-30a、miR-15b-5p水平均與肺功能指標(FEV1、FVC、FEV1/FVC)及巨噬細胞呈負相關,與細胞總數、中性粒細胞、嗜酸粒細胞、淋巴細胞數目呈正相關(P<0.05),說明miR-30a、miR-15b-5p與支氣管哮喘患兒氣道炎癥及氣流受限關系密切,且外周血miR-30a、miR-15b-5p水平升高可能導致患兒發生氣道炎癥反應及呼氣氣流受限,進而加重疾病進展。本研究ROC曲線分析顯示,外周血miR-30a、miR-15b-5p預測小兒支氣管哮喘發生的曲線下面積為0.841、0.862,說明外周血miR-30a、miR-15b-5p均對小兒支氣管哮喘的發生有著良好的預測價值,且其水平超過截斷值,提示存在支氣管哮喘發生風險。

相關研究報道,支氣管哮喘發作與氣道炎癥、變態反應、氣道高反應性等相互作用有關[16]。既往研究顯示,外周血淋巴細胞中miR-30a-5p高表達可使膿毒癥患者促炎因子表達上調,抗炎因子表達受到抑制[17],而血清miR-30a也與膿毒癥病情嚴重程度有關[18]。而既往研究涉及更多的是miR-15b-5p調節腫瘤細胞生長與凋亡的功能,但有研究發現,血清miR-15相對表達量參與潰瘍性結腸炎患者炎性反應狀態[19]。因此本研究推測,外周血miR-30a、miR-15b-5p水平升高可機體出現炎癥反應,因此有可能導致支氣管哮喘發生。另外研究發現,外周血miR-30a聯合miR-15b-5p預測小兒支氣管哮喘發生的曲線下面積高于單一指標,說明二者聯合應用更有助于診斷小兒支氣管哮喘發生,從而可為臨床及時采取積極有效的治療干預措施提供依據。

綜上所述,支氣管哮喘患兒外周血miR-30a、miR-15b-5p水平均呈高表達,且水平變化與氣道炎癥、肺功能密切相關,另外可作為預測支氣管哮喘患兒發病的有效指標。但本研究為單中心樣本分析,可能存在選擇偏倚,因此后續研究中將擴大樣本來源單位進一步分析。