CTLA-4納米抗體與腫瘤適配體共修飾的雙靶向脂質體構建*

萬瑞融 王希斌

廣西醫科大學第一附屬醫院藥學部,廣西南寧市 530021

免疫療法是惡性腫瘤繼手術、放療和化療之外的第四種治療新方法,其中把T淋巴細胞作為腫瘤殺傷的效應細胞稱之為過繼療法,是腫瘤免疫治療的良好策略之一[1]。但是傳統的T細胞過繼治療肝癌方法,難以獲得滿意的募集效應細胞至腫瘤部位效應,同時缺乏靶向識別腫瘤細胞和正常細胞的能力,因此需要尋找新的策略來提高T細胞過繼治療的效果。

雙特異性抗體(Bispecific antibody,BsAb)是指能夠同時靶向兩個抗原或者一個抗原的兩個不同表位的基因工程抗體。由于其特異性和雙功能性,現已在腫瘤治療及自身免疫病等領域中引起廣泛關注[2]。適配體是一類分子量小、易于修飾合成、低毒低免疫原性、組織滲透性強等優點的靶向識別分子,也已在生物醫藥領域開展了廣泛研究[3]。本項目設想通過CTLA-4納米抗體阻斷T細胞活化過程中的負性共刺激分子而進一步誘導T細胞的殺傷腫瘤效應,同時聯合適配體的腫瘤細胞靶向識別能力,構建一種新型的BsAb,希望其能將更高效能的T細胞靶向募集至腫瘤部位,從而發揮腫瘤的特異性殺傷作用。因此,本研究利用前期工作已經篩選出的CTLA-4特異性納米抗體Nb16[4],結合能特異性結合肝癌細胞HepG2的TLS11a適配體,制備一種新型的BsAb,有望為腫瘤的免疫治療提供一條有潛在臨床應用價值的新策略。

1 材料與方法

1.1 主要材料 1-棕櫚酰基-2-硬脂酰基(POPC)、雙十八烷基溴化銨(DDAB)、膽固醇(Chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺—聚乙二醇2000 (DSPE-PEG2000)、磷脂聚乙二醇馬來酰亞胺[DSPE-PEG(2000)-MAL],購自美國Avanti polar lipids公司。修飾巰基的適配體由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其序列為:5’-ACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTGTTACGGTTTCCGCCTC-ATGGACGTGCTGTTTTTTTTTT-SH-3’。

1.2 實驗儀器 高速離心機(Thermo,德國),冷凍干燥機(Martin Christ,德國),小型噴霧干燥器,Nano-S 型激光粒度分析儀(Malvern,英國),透射電子顯微鏡(日立,日本),流式細胞儀(Beckman,美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 雙靶向脂質體的制備。(1)采用薄層水化法制備空載脂質體(Lipo):將POPC、Chol、DSPE-PEG2000、DDAB和DSPE-PEG(2000)-MAL按質量摩爾比52∶40∶5∶3∶0.3比例溶解到圓底燒瓶的氯仿溶液中,然后使用旋轉蒸發儀(設定溫度為60℃)旋轉蒸發10min便可得到脂質薄膜狀固體。連同圓底燒瓶將所得脂質薄膜放置于真空干燥儀中干燥過夜,除去殘留有機溶劑。然后將瓶底的脂質薄膜用1ml 300mmol/L的枸櫞酸緩沖液 (pH=4.0) 進行水化,隨后置于50℃的水浴中超聲20min,再使用液氮和60℃水浴循環凍融5次。將所得產物裝入脂質體擠推器,依次通過200nm、100nm的聚碳酸酯膜各20次,最后便可得到直徑約100nm的空白脂質體。(2)制備適配體和納米抗體共修飾的雙靶向脂質體:納米抗體、適配體、脂質體按照質量摩爾比1∶1∶10的比例混合到PBS溶液中,混勻,然后4℃條件下震蕩孵育 24h,最后使用HEPES透析后即可獲得Nb16-Lipo-TLS11a。(3)制備熒光脂質體:在全程避光條件下,將納米抗體、適配體、脂質體、FITC熒光染料按質量摩爾比1∶1∶10∶1混合到PBS溶液中,然后按照制備Nb16-Lipo-TLS11a一樣的步驟進行,便可得到帶熒光的F-Nb16-Lipo-TLS11a。(4)為了驗證雙靶向脂質體的體外靶向性能,我們還制備了單一修飾的熒光脂質體,包括只修飾適配體脂質體(Lipo-TLS11a)和只修飾納米抗體的脂質體(Nb16-Lipo),即在上述空白脂質體中分別只加入適配體或納米抗體溶液混勻,余步驟同前。

1.3.2 雙靶向脂質體的表征。使用Zetasizer粒度電位儀測量和分析脂質體的粒徑和電位;通過透射電子顯微鏡觀察并拍攝脂質體的形態特點。

1.3.3 雙靶向脂質體體外靶向活性檢測。流式細胞儀實驗。采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法從健康供體的全血中分離出人外周血單核細胞(PBMCs)(已提供知情同意書)。將PBMCs懸浮于含10% FBS的RPMI-1640培養基中1h。去除未貼壁細胞,然后用尼龍羊毛纖維分離T細胞。所有流式細胞實驗均在4℃下進行。使用植物血凝素PHA( 10μg/ml)刺激T細胞,然后將3×105刺激的T細胞在30min內用PBS/2% BSA溶液振蕩飽和,以避免非特異性結合。在PBS/2% BSA中加入熒光雙靶向脂質體F-Nb16-Lipo-TLS11a(設置另外一組加入只修飾適配體的脂質體Lipo-TLS11),孵育30min。PBS洗滌3次后,流式細胞儀檢測結合情況。

檢測雙靶向脂質體與肝癌細胞HepG2和人正常肝細胞HL-7702的結合:取對數生長期的HepG2細胞,同時設置不能與適配體TLS11a結合的HL-7702細胞作為對照,分別取3×105細胞于50μl PBS溶液中重懸,然后加入40μl PBS溶液、10μl胎牛血清和熒光雙靶向脂質體F-Nb16-Lipo-TLS11a混勻(設置另外一組加入只修飾納米抗體的脂質體Nb16-Lipo),混勻,于4℃、避光條件下孵育30min,最后使用PBS 洗滌細胞并離心5min,重復洗滌3次,最后重懸細胞進行流式細胞術檢測。以上流式細胞術所獲得數據均采用Flow Jo軟件進行分析。

2 結果

2.1 雙靶向脂質體的表征 通過TEM觀察可以看到(見圖1a),雙靶向脂質體Nb16-Lipo-TLS11a具有圓球形或橢圓球形形態,大小均質,而且分散性良好。空載脂質體Lipo的平均水化粒徑是94.57nm,在逐步修飾納米抗體和適配體后,平均粒徑分別增大至99.67nm與103.43nm(見圖1b)。電位檢測顯示(見圖1c),無修飾的空載脂質體的平均電位為18.76mV,由于適配體核酸序列和納米抗體蛋白表面為負電荷,因此在修飾雙靶向分子后,靶向脂質體電位發生了負向偏移。經過檢測,雙靶向脂質體表面平均電位為9.14mV,這說明適配體修飾成功。

圖1 雙靶向脂質體的表征

2.2 流式細胞儀分析雙靶向脂質體的體外靶向能力 為了分析雙靶向脂質體Nb16-Lipo-TLS11a結合PHA刺激的人T細胞的能力,進行了流式細胞術試驗。結果表明,只修飾適配體的脂質體Lipo-TLS11a不能結合活化的T細胞,而雙靶向脂質體Nb16-Lipo-TLS11a能識別活化的T細胞 (見圖2a),說明雙靶向脂質體修飾納米抗體后擁有了靶向結合T細胞上的CTLA-4位點的能力。同時,雙靶向脂質體Nb16-Lipo-TLS11a也能識別表達肝癌HepG2細胞 (見圖2b),卻無法靶向結合HL-7702細胞(見圖2c),說明雙靶向脂質體通過修飾適配體后,具備了特異性識別腫瘤細胞的能力。

圖2 流式細胞儀檢測雙靶向脂質體的體外靶向能力

3 討論

細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4 (Cytotoxic Tlymphocyte-associated Antigen-4,CTLA-4) 受體是第一個用作臨床靶標的免疫檢查點[5],也是T 細胞表面最具代表性的免疫抑制點分子。目前,人們利用CTLA-4抗體阻斷T細胞活化過程中CTLA-4對T細胞活化后的抑制,從而促進機體的抗腫瘤免疫應答,使獲得滿意的抗腫瘤效應成為可能。然而傳統抗體在實際應用中仍存在問題亟待解決,如抗體分子量大,在瘤內的穿透性欠佳等,因此有必要建立更加高效、穿透力強的新型抗體用于腫瘤治療。抗體人源化、高效化及小型化均已成為當前抗體藥物研究的主要趨勢[6]。納米抗體(Nanobody,Nb)是目前可以得到的穩定的可結合抗原的最小單位[7]。納米抗體是一種小型的基因工程抗體,由于它具備良好穩定性、強組織穿透力及較弱的免疫原性,使其在腫瘤免疫治療等方面展現巨大的應用潛力[8]。本課題組前期已篩選出了CTLA-4特異性的納米抗體Nb16,實驗證明其與CTLA-4抗原有較好的結合力與活性[4],具有巨大的應用潛力。

阻斷CTLA-4對T細胞活化后的抑制還不夠,如何將腫瘤殺傷效應T細胞富集至腫瘤部位也是目前研究的熱點方向。適配體能夠通過三維結構以高親和力特異性結合在靶標上,能夠為主動靶向腫瘤細胞提供理想的靶向分子,被廣泛應用于藥物靶向治療及腫瘤檢測等領域[9-10]。因此,本研究首次將納米抗體和適配體聯合,結合納米技術,以脂質體為連接介質,將這兩種具有不同靶向效能的小分子連接,從而構建一種具有BsAb功能的雙靶向脂質體Nb16-Lipo-TLS11a。本實驗結果初步證明了Nb16-Lipo-TLS11a構建成功,并且其具有同時靶向結合PHA活化的T細胞和腫瘤細胞HepG2的能力。但是,Nb16-Lipo-TLS11a是否能將活化T細胞定向募集至腫瘤細胞,實現對腫瘤的高效且特異性殺傷,還有待本課題組在后續實驗中進一步驗證。

總之,本研究制備了一種CTLA-4納米抗體與腫瘤適配體共修飾的雙靶向脂質體Nb16-Lipo-TLS11a。理論上,這種脂質體能通過Nb16阻斷T淋巴細胞活化過程中的負性共刺激分子而進一步誘導T細胞的殺傷腫瘤效應,同時基于適配體對腫瘤細胞的靶向識別能力,可以將腫瘤殺傷T淋巴細胞靶向募集至腫瘤部位進行特異性殺傷。而且,通過替換靶向不同靶標的適配體,可以實現對各種腫瘤的靶向治療,為腫瘤的免疫治療提供了新思路。