豬傳染性胸膜肺炎疫苗抗原ApxⅡ在谷氨酸棒桿菌中的表達及發酵條件優化

摘要：" 豬胸膜肺炎放線桿菌是一種高度傳染性、致死性呼吸道疾病，已造成養豬業嚴重損失。細胞毒素Apx Ⅱ是豬胸膜肺炎PCP（Porcine contagious pleuropneumonia）的主要抗原之一，可以作為豬胸膜肺炎疫苗的有效成分。谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）具有無內毒素和較發達分泌系統的優點，是非常有潛力的重組細菌疫苗蛋白質表達系統。利用C.glutamicum表達系統生產Apx Ⅱ，實現其高效穩定表達，可為疫苗生產提供技術基礎。前期研究已構建Apx Ⅱ分泌表達菌株，為進一步提高Apx Ⅱ的表達產量，通過在24孔板發酵優化，得到最優的培養基為CGXⅡ-YT，最優的表達溫度為30 ℃，IPTG濃度為1.0 mmol/L，加入IPTG前培養6 h，發酵培養時間為24 h。進一步在搖瓶中放大發酵培養結果與24孔板發酵培養結果相同。最后在容積為5 L發酵罐中對Apx Ⅱ進行表達，與使用基礎發酵培養基發酵相比，使用CGXⅡ-YT發酵培養基，且在優化后的發酵條件下Apx Ⅱ表達量明顯提高，達到了114.60 mg/L。本研究實現了Apx Ⅱ在谷氨酸棒桿菌中的分泌表達，為其進一步擴大化生產提供了基礎。

關鍵詞：" 細胞毒素ApxⅡ；谷氨酸棒桿菌；表達

中圖分類號：" S858.28""" 文獻標識碼：" A""" 文章編號：" 1000-4440（2024）12-2310-07

收稿日期：2024-02-08

基金項目：國家自然科學基金項目（22078128）

作者簡介：程世前（1996-），男，河南義馬人，碩士，主要從事發酵工程、醫藥蛋白表達等方面的研究。（E-mail）c5886602123@163.com

通訊作者：白仲虎，（E-mail）baizhonghu@jiangnan.edu.cn

程世前，康競藝，陳萌軒，等. 豬傳染性胸膜肺炎疫苗抗原ApxⅡ在谷氨酸棒桿菌中的表達及發酵條件優化［J］. 江蘇農業學報，2024，40（12）：2310-2316.

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.12.014

Expression of porcine contagious pleuropneumonia vaccine antigen ApxⅡ in Corynebacterium glutamicum and optimization of fermentation conditions

CHENG Shiqian1，" KANG Jingyi1，" CHEN Mengxuan1，" LIU Xiuxia1，2，3，" YANG Yankun1，2，3，" BAI Zhonghu1，2，3

（1.National Engineering Research Center of Cereal Fermentation and Food Biomanufacturing， Jiangnan University， Wuxi 214122， China;2.Key Laboratory of Industrial Biotechnongy， Ministry of Education， Jiangnan University， Wuxi 214122， China;3.Jiangsu Engineering and Technology Research Centre for Bioactive Product Processing， Wuxi 214122， China）

Abstract：" Actinobacillus pleuropneumoniae is a highly infectious and fatal respiratory disease， which has caused serious losses in the pig industry. Apx Ⅱ is one of the main antigens of porcine contagious pleuropneumonia （PCP）， which can be used as an effective component of porcine pleuropneumonia vaccine. Corynebacterium glutamicum has the advantages of endotoxin-free and more developed secretion system， and is a very promising recombinant bacterial vaccine protein expression system. The expression system of C. glutamicum was used to produce Apx Ⅱ and achieve its efficient and stable expression， which could provide a research basis for vaccine production. Apx Ⅱ secretory expression strains were constructed in previous studies. In order to further improve the expression yield of Apx Ⅱ， the fermentation in 24-well plates was optimized. The optimal medium was CGXII-YT， and the optimal expression temperature was 30 ℃. The concentration of IPTG was 1.0 mmol/L， the culture time was 6 h before adding IPTG， and the fermentation culture time was 24 h. The results were the same as those of 24-well plate fermentation. Finally， Apx Ⅱ was expressed in a 5 L fermentor. Compared with the basic fermentation medium， the Apx Ⅱ expression yield was significantly increased by using CGXⅡ-YT fermentation medium， and the Apx Ⅱ expression yield reached 114.60 mg/L under the optimized fermentation conditions. In this study， the secretory expression of Apx Ⅱ in Corynebacterium glutamicum was realized， which provided a basis for its further expansion of production.

Key words： "cytotoxin ApxⅡ;Corynebacterium glutamicum;expression

豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumonia， APP）是豬傳染性胸膜肺炎的病原體，具有高度傳染性，通常是致命的，已成為豬的主要傳染病原菌之一，對世界養豬業造成巨大影響。典型的亞單位疫苗有轉鐵結合蛋白質（Tbp）、蛋白酶、滲透因子和菌毛等。其中，細胞毒素Apx、Tbp具有免疫原性，是APP的抗原，可以作為疫苗的有效成分。細胞毒素Apx會破壞菌體自身形態造成發病。ApxⅡ是除了血清型10外，都能體現Apx的一類毒素，所以ApxⅡ是Apx毒素中最有前途的候選疫苗。Wang等通過給豬單獨注射或添加到由重組ApxI、ApxII、ApxIII毒素和外膜蛋白質組成的多組分重組亞單位疫苗中，結果發現對各種豬傳染性胸膜肺炎（PCP）免疫反應都有一定的防護性。然而中國新型疫苗研究起步較晚，研究主體有高校和科研院所，如何實現獸用疫苗高質量、低成本生產仍然是各大疫苗企業關注的重點。

谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）于1950年首次被科學家發現，因其具備高產L-谷氨酸的特點，故命名為谷氨酸棒桿菌。C.glutamicum屬于放線綱放線菌目棒狀桿菌屬，特點是嚴格好氧，不產生孢子且血清甘膽酸（CG）含量高，被認作是食品級安全型微生物。研究結果發現，谷氨酸棒桿菌在重組蛋白質分泌途徑上同樣具備此類特性，首先它具有非常優良的無內毒素特征，不會影響疫苗質量；其次是它的分泌表達體系完善，包含兩個完善的分泌途徑（Sec途徑和Tat途徑），具有很好的表達蛋白體系；最后是其在胞外具有很少的蛋白酶。

本研究首先利用多孔板將ApxⅡ在谷氨酸棒桿菌中進行發酵條件優化，然后將其發酵工藝放大至搖瓶水平以及容積為5 L發酵罐水平，驗證此發酵工藝的有效性，并首次在容積為5 L發酵罐中進行谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647分泌表達ApxⅡ，探究谷氨酸棒桿菌對ApxⅡ表達的可行性，對其作為宿主菌株表達外源蛋白生產疫苗提供可行性方案。

1" 材料與方法

1.1" 菌株和質粒

Apx Ⅱ表達載體pXMJ19-tac-CspB-ApxⅡ#5和谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647均由江南大學實驗室保存。

1.2" 培養基的配制

種子培養基（LBB）：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，BHI 10 g/L。基礎發酵培養基：MgSO4 1 g/L，（NH4）2SO4 20 g/L，KH2PO4 1 g/L，BHI 30 g/L，葡萄糖 30 g/L。補料培養基：葡萄糖300 g/L。 供試發酵培養基有LB、LBB、BHI、CGXⅡ、CGXⅡ-YT。

1.3" 主要儀器和試劑

質粒提取使用CWBIO試劑盒（江蘇康為世紀生物科技股份有限公司產品）。序列插入使用DNA連接酶，聚合酶鏈反應（PCR）使用Es Taq聚合酶（江蘇康為世紀生物科技股份有限公司產品）或PrimerSTAR進行。DNA連接酶購自賽默飛世爾科技公司；氯霉素購于上海麥克林生化科技股份有限公司；其余培養基試劑均從上海國藥集團有限公司購置。使用的儀器包括成都英德生物醫藥設備有限公司生產的恒溫搖床，賽默飛世爾科技公司生產的高速冷凍離心機、PCR儀、超低溫冰箱和凝膠成像儀，瑞士Tecan公司生產的多功能酶標儀，天根生化科技（北京）有限公司生產的恒溫金屬浴，上海天能科技有限公司生產的核酸電泳系統、蛋白質凝膠電泳系統，上海棱光技術有限公司生產的紫外分光光度計等。

1.4" 應用24孔板與搖瓶培養ApxⅡ

挑取培養皿中單克隆菌株接種到搖瓶中（瓶中含10 mL LBB培養基），并放于30 ℃恒溫培養箱中220 r/min培養12 h，隨后吸取200 μL上述種子液至深孔板中（24孔，每孔含1.8 mL LBB 培養基），再次放入30 ℃恒溫培養箱中培養4～6 h，當孔內菌體呈生長狀態后添加適量濃度為1 mmol/L的誘導劑IPTG，培養24 h后在600 nm波長下測定吸光度（OD600），繪制生長柱圖。在搖瓶培養中，挑取單克隆菌株進行接種（LBB培養基體積占搖瓶容積的1/10），隨后放置在30 ℃恒溫培養箱中220 r/min培養12 h后，吸取1 mL上述種子液至新的搖瓶培養基中，保持30 ℃恒溫，220 r/min培養4～6 h，再向搖瓶中添加適量濃度為1 mmol/L的誘導劑IPTG繼續培養24 h，測定OD 600，繪制生長柱圖。

1.5" ApxⅡ 5 L發酵罐分批補料培養

單菌落在LBB培養基中培養12 h后，按10%接種量轉接到5 L發酵罐中（罐內含1.8 L發酵培養基）。在發酵培養過程中轉速設定與溶解氧含量相偶聯，其溶解氧設定為30%，pH設定為7，用氨水和10%磷酸調節pH，罐體溫度設定為30 ℃。每4 h取1次樣，整個培養過程中轉速設定為450～1 000 r/min。發酵8 h時后加入1 mmol/L的IPTG誘導表達并開啟補料循環泵（補充300 g/L的葡萄糖），流速為4 mL/（h·L）。每隔4 h取樣1次，測定OD600，繪制生長圖。

1.6" ApxⅡ SDS-PAGE分析和BSA蛋白濃度

將蛋白質樣品離心后取上清液分別與5×上樣緩沖液混合，制備成SDS-PAGE蛋白凝膠電泳樣品。所有的樣品用質量濃度為120 g/L的SDS-PAGE進行分析，隨后用考馬斯亮藍染色10 min并放置于勻速搖板上搖晃，去染色液后加入脫色液過夜，搖晃直至膠體變透亮后進行凝膠成像拍攝。蛋白質質量濃度測定使用BCA試劑盒，將蛋白質標品定量分別配制成0.025 mg/L、0.050 mg/L、0.100 mg/L、0.200 mg/L、0.300 mg/L、0.400 mg/L、0.500 mg/L的標準品，利用凝膠成像圖分析蛋白質純度，根據不同質量濃度BSA繪制標準柱圖，使用軟件Image J測定數值隨后代入標準柱圖中定量蛋白質ApxⅡ。

2" 結果與分析

2.1" 多孔板水平ApxⅡ生產的發酵條件優化

2.1.1" ApxⅡ培養基的確定" 為確定用于優化ApxⅡ生產的基礎培養基，選用LB、LBB、BHI、CGXⅡ、CGXⅡ-YT 5種培養基，對獲得ApxⅡ最優表達重組菌株進行發酵培養。種子培養基使用LBB，將平板上單菌落菌株接種到搖瓶內LBB培養基中，30 ℃、220 r/min過夜培養。按照2%接種量將其分別轉接到BHI、LB、LBB、CGXⅡ及CGXⅡ-YT搖瓶培養基中，經24 h搖床發酵培養后，測定其生物量并進行SDS-PAGE分析。選擇表達量最高的CGXⅡ-YT培養基為ApxⅡ生產培養基（圖1）。

2.1.2" 碳源對ApxⅡ表達的影響" 在24孔板中分別將果糖、蔗糖、山梨醇、甘油、葡萄糖、木糖、麥芽糖、乙醇添加到不含葡萄糖碳源的CGXⅡ-YT培養基中，使其最終質量濃度達到10 g/L；再分別接入10%等量的ApxⅡ種子培養基，在30 ℃和220 r/min 條件下誘導后培養24 h，收集發酵液的上清液，測定其生物量并進行SDS-PAGE分析。根據圖2所示，當葡萄糖作為碳源時，其細菌生長情況與ApxⅡ表達水平均最佳，因此后續使用葡萄糖作為碳源。

2.1.3" 氮源對 ApxⅡ表達的影響" 在24孔板中分別將Yeast extract（進口）、Tryptone（進口）、大豆蛋白胨、酵母浸膏、硫酸銨、酪蛋白水解物、尿素、氯化銨添加到不含氮源的CGXⅡ-YT培養基中，使其最終質量濃度達到18 g/L。分別接入10%等量的ApxⅡ種子培養基，在30 ℃和220 r/min 條件下培養24 h，收集發酵液的上清液，測定其生物量并進行SDS-PAGE分析。根據圖3所示，大豆蛋白胨作為氮源時，其細菌生長情況與ApxⅡ表達水平均為最佳，因此選擇大豆蛋白胨作為氮源。

2.1.4" 誘導溫度對ApxⅡ表達量的影響" 為探究誘導溫度是否有利于ApxⅡ的可溶表達。在24孔板中使用不同誘導溫度，觀察其對ApxⅡ表達量的影響。發酵前期在30 ℃條件下培養6 h，然后加入誘導劑分別調節溫度至20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、35 ℃。如圖4所示，誘導溫度為30 ℃時ApxⅡ的表達水平最高，后續試驗誘導溫度選用30 ℃。

2.2" 搖瓶中ApxⅡ生產的發酵條件優化

將先前探究的24孔板Apx Ⅱ表達條件放大到搖瓶規模進行Apx Ⅱ表達，根據不同誘導溫度和誘導劑添加量，在CGXⅡ-YT培養基中接入10%種子培養基，在30 ℃和220 r/min 條件下培養24 h，測量表達菌株生物量并取樣品上清液進行分析。如圖5所示，在搖瓶規模放大試驗中獲得最佳條件為：誘導溫度30 ℃，誘導劑添加濃度為1 mmol/L IPTG。

2.3" ApxⅡ在5 L發酵罐中的表達

將ApxⅡ表達菌株在LBB培養基中培養12 h，然后按10%接種量轉接到含有1.8 L發酵培養基的容積為5 L的發酵罐中。在發酵培養過程中，發酵12 h后加入1 mmol/L的IPTG誘導表達并開啟補料循環泵，流速為4 mL/（h·L）。每隔4 h取樣1次，

記錄OD600，離心去樣品上清液與5×上樣緩沖液混合后進行SDS-PAGE分析，將BSA蛋白標準品梯度稀釋后進行SDS-PAGE分析和灰度分析，將分析結果代入BSA標品驗證圖中對ApxⅡ的表達進行定量，使用基礎發酵培養基，ApxⅡ在5 L發酵罐中的產量為84.99 mg/L；使用CGXⅡ-YT發酵培養基且在優化后的發酵條件下培養發酵ApxⅡ表達菌株，5 L發酵罐中ApxⅡ表達量達到114.60 mg/L（圖6）。

3" 討論與結論

由于豬胸膜肺炎傳播力強、危害大，疫苗接種是預防其暴發的有效策略。其中Apx為其放線桿菌的毒素，所包含的ApxⅡ是解決豬胸膜肺炎亞單位疫苗的重要環節。前人研究多通過大腸桿菌來表達ApxⅡ，其包涵體情況尤為突出，很大程度上影響了ApxⅡ的分泌表達。使用谷氨酸棒桿菌進行ApxⅡ的表達，既符合疫苗安全生產的要求，又符合實際生產中對疫苗產量的要求，為進行亞單位疫苗生產提供了一個全新的方向。

本研究以谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647為表達宿主，進行ApxⅡ的分泌表達，實現了ApxⅡ可溶性表達的能力。在24孔板中通過確定基礎培養基，優化培養基碳源和氮源成分、發酵溫度等發酵條件，提高了ApxⅡ的表達量，并在搖瓶中進行了放大驗證，隨后在5 L發酵罐中對培養基分批補料進行探索與優化，首次將ApxⅡ表達在谷氨酸棒桿菌中進行5 L發酵罐放大試驗，使用基礎發酵培養基，在5 L發酵罐中ApxⅡ表達量為84.99 mg/L，發酵條件優化后使用CGXⅡ-YT培養基，5 L發酵罐中ApxⅡ表達量提升到114.60 mg/L。

本研究實現了ApxⅡ在谷氨酸棒桿菌的高效可溶性表達，并首次進行了放大培養，初步優化發酵條件，為后續的放大化生產和應用提供了基礎。

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（責任編輯：黃克玲）