基于KASP標(biāo)記的厚皮甜瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建

摘要：" 本研究通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（KASP）標(biāo)記對(duì)厚皮甜瓜核心種質(zhì)資源進(jìn)行多態(tài)性分析，以期篩選厚皮甜瓜種質(zhì)資源的單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記，應(yīng)用于厚皮甜瓜種質(zhì)資源及品種的純度鑒定和指紋圖譜構(gòu)建。從公布的297份甜瓜重測(cè)序數(shù)據(jù)中挑選95份厚皮甜瓜重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)，對(duì)課題組的20份核心厚皮甜瓜種質(zhì)資源進(jìn)行多態(tài)性分析。結(jié)果顯示，共計(jì)開(kāi)發(fā)50個(gè)SNP標(biāo)記，分布在甜瓜12條染色體中。50個(gè)SNP標(biāo)記中，有23個(gè)SNP標(biāo)記能夠?qū)⒈狙芯恐械?9份核心厚皮甜瓜種質(zhì)資源進(jìn)行分型，其中Marker33、Marker38、Marker23、Marker36、Marker47、Marker42 6個(gè)標(biāo)記能夠完全區(qū)分19份甜瓜種質(zhì)資源，本研究結(jié)果可以為后期厚皮甜瓜種質(zhì)資源和品種純度鑒定提供有利的支撐。

關(guān)鍵詞：" 厚皮甜瓜；單核苷酸多態(tài)性；競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR；遺傳多樣性；指紋圖譜

中圖分類(lèi)號(hào)：" S652.9""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：" A""" 文章編號(hào)：" 1000-4440（2024）12-2349-07

收稿日期：2024-03-05

基金項(xiàng)目：江蘇省種業(yè)振興揭榜掛帥項(xiàng)目；江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（西甜瓜）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系甜瓜育種栽培創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：孫國(guó)勝（1987-），男，山東萊州人，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)槭卟俗魑镞z傳育種。（E-mail）sgs8725@163.com

通訊作者：馬志虎，（E-mail）mazhihu830@163.com

孫國(guó)勝，張昌偉，山" 溪，等. 基于KASP標(biāo)記的厚皮甜瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2024，40（12）：2349-2355.

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.12.018

Analysis of genetic diversity and construction of fingerprints for core germplasms of muskmelon based on KASP markers

SUN Guosheng1，2，" ZHANG Changwei2，" SHAN Xi1，" XU Dingfan1，" DAI Zhongliang1，" ZHANG Zhenchao1，MA Zhihu1

（1.Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences in Hilly Area of Jiangsu Province， Zhenjiang 212400， China;2.Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract：" In this study， we analyzed the polymorphism of core resources of muskmelon by competitive allele-specific PCR （KASP） markers， with a view to screening single nucleotide polymorphism （SNP） markers of muskmelon resources， which could be applied to the purity identification and fingerprint construction of the parents and hybrids of muskmelon. From the published 297 melon resequencing data， 95 muskmelon resequencing data were selected for SNP marker development， and polymorphism analysis was performed on 20 core muskmelon germplasm resources of the subject group. The results showed that a total of 50 SNP markers were developed， and distributed on 12 chromosomes of muskmelon. Among the 50 SNP markers， 23 SNP markers could be used to genotype 19 core muskmelon resources. Six markers including Marker33， Marker38， Marker23， Marker36， Marker47 and Marker42 could completely distinguish 19 muskmelon germplasm resources. The results of this study provide favorable support for the identification of muskmelon resources and variety purity in the later stage.

Key words：" muskmelon;single nucleotide polymorphism （SNP）;competitive allele-specific PCR （KASP）;genetic diversity;fingerprint

甜瓜（Cucumis melo L.）是中國(guó)優(yōu)勢(shì)園藝經(jīng)濟(jì)作物，其栽培歷史悠久，大約于北魏時(shí)期與西瓜一同傳入中國(guó)，至明朝開(kāi)始被廣泛種植。西北大陸性氣候地區(qū)，如新疆、甘肅等地是厚皮甜瓜的傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)，如新疆哈密地區(qū)生產(chǎn)的“哈密瓜”已然成為網(wǎng)紋甜瓜的一個(gè)統(tǒng)稱(chēng)。聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)2022年甜瓜栽培面積約3.92×105 hm2，產(chǎn)量約1.425×107 t，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占重要地位。自“十三五”以來(lái)，中國(guó)甜瓜育種事業(yè)迎來(lái)了較好的發(fā)展，尤其是隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)甜瓜育種技術(shù)結(jié)合生物育種技術(shù)，選育出一批適宜中國(guó)生態(tài)環(huán)境的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的甜瓜品種，助力鄉(xiāng)村振興。

伴隨第三代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展，單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記成為被廣泛應(yīng)用的分子標(biāo)記之一。SNP是基因組水平上出現(xiàn)的單堿基因素引起的DNA多態(tài)性，在自然條件下，發(fā)生單堿基突變的頻率約為1×10-8，且SNP在基因組中存在豐富的變異，遺傳穩(wěn)定性高，又具有雙等位、高密度和共顯性等特點(diǎn)，使得SNP的使用越來(lái)越廣泛。使用競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（KASP）技術(shù)進(jìn)行SNP檢測(cè)，其典型特點(diǎn)是成本低、兼容性較高、靈敏度高、對(duì)檢測(cè)樣本數(shù)量要求不高，KASP技術(shù)可以應(yīng)用到作物分子標(biāo)記輔助育種研究中。SNP目前已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于作物的遺傳分析及純度鑒定。2012年，Gao等篩選了18對(duì)簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）引物，構(gòu)建了471份甜瓜資源的DNA指紋圖譜，但是標(biāo)記數(shù)量少，難以成為全基因組篩選工具。2020年Liu等對(duì)297份甜瓜資源進(jìn)行重測(cè)序，揭示了甜瓜基因組改良?xì)v史以及與果實(shí)性狀相關(guān)的基因位點(diǎn)，共獲得2 045 412個(gè)高質(zhì)量的 SNP標(biāo)記，對(duì)于了解甜瓜的遺傳多樣性、品種改良和果實(shí)性狀的遺傳有很大幫助。

為了加速SNP標(biāo)記在甜瓜育種，尤其是厚皮甜瓜育種中的應(yīng)用，我們選取Liu等公布的297份甜瓜種質(zhì)資源重測(cè)序數(shù)據(jù)中的95份厚皮甜瓜數(shù)據(jù)，通過(guò)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的重新分析開(kāi)發(fā)出能夠用于厚皮甜瓜純度鑒定的SNP標(biāo)記， 對(duì)項(xiàng)目組的20份厚皮甜瓜核心資源進(jìn)行分型，并完成厚皮甜瓜核心種質(zhì)資源的遺傳進(jìn)化分析，了解厚皮甜瓜資源的親緣關(guān)系，為甜瓜雜交種純度鑒定提供理論依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 甜瓜資源

試驗(yàn)采用的甜瓜資源是江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所蔬菜花卉研究室自有的厚皮甜瓜核心種質(zhì)資源，具體性狀見(jiàn)表1。

甜瓜種子播種于72孔穴盤(pán)，放置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25 ℃、14 h（光）;20 ℃、10 h（暗）。兩葉一心時(shí)，取2片真葉提取DNA，備用。

1.2" 甜瓜葉片DNA的提取

20份甜瓜資源播種在江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所行香創(chuàng)新基地試驗(yàn)室，植株長(zhǎng)至2片真葉時(shí)，將第2片真葉去除葉脈后取0.1 g，采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取總DNA。

1.3" KASP分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)和基因型分型

1.3.1" SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)" 將甜瓜基因組和Liu等報(bào)道的95份厚皮甜瓜種質(zhì)資源基因重測(cè)序數(shù)據(jù)（LDR_M和IMP_M類(lèi)型）進(jìn)行比對(duì)，利用Vcftools軟件（版本：0.1.16）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾參數(shù)設(shè)置為平均深度≥5×，標(biāo)記質(zhì)量值＞30，最小完整度＞0.9，最小等位基因頻率=0.05，雙等位標(biāo)記，多態(tài)信息含量≥0.2，期望雜合度＞0.2。采用RepeatMasker軟件（版本：4.1.0）剔除重復(fù)序列中的SNP標(biāo)記；截取SNP標(biāo)記上游、下游各100 bp序列，然后使用BLAST軟件（版本：2.10.1+）將序列與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，去除比對(duì)上2個(gè)（包括原有位置）及2個(gè)以上位置的標(biāo)記；使用Primer3軟件（版本：2.4.0）固定上游引物位置設(shè)計(jì)引物。每隔2 Mb選取1個(gè)標(biāo)記，保證標(biāo)記在染色體上均勻分布。

1.3.2" KASP引物合成和基因型分型" 根據(jù)開(kāi)發(fā)的SNP位點(diǎn)前后序列信息，將SNP位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為KASP標(biāo)記。分別以引物F1和F2末端堿基為參考基因組的堿基和SNP位點(diǎn)，在引物F1的5′端添加熒光羧基熒光素（FAM）標(biāo)簽序列GAAGGTGACCAAGTTCAT；在引物F2的5′端添加羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（VIC）熒光標(biāo)簽序列GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。

將所提取的DNA稀釋至20 ng/μL，PCR反應(yīng)體系為5.00 μL：KASP酶混合物2.50 μL、DNA 1.00 μL、引物F1 0.10 μL、引物F2 0.10 μL、引物R 0.30 μL、雙蒸餾水（ddH2O） 1.00 μL。在BioRad實(shí)時(shí)定量?jī)x上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用儀器自帶軟件進(jìn)行基因分型及數(shù)據(jù)分析。

1.4" 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

利用MEGA 7.0 軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)的基因型進(jìn)行聚類(lèi)分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（采用鄰接法，Bootstrap值為1 000）。

2" 結(jié)果與分析

2.1" SNP標(biāo)記多態(tài)性驗(yàn)證

將甜瓜基因組數(shù)據(jù)與95份厚皮甜瓜種質(zhì)資源重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，使用Vcftools（版本：0.1.16）進(jìn)行過(guò)濾，得到59 632個(gè)SNP標(biāo)記（圖1）；去除比對(duì)上的多個(gè)位置的標(biāo)記后，得到52 831個(gè)SNP標(biāo)記；保留多態(tài)信息含量（PIC）大于0.2的標(biāo)記，過(guò)濾得到12 589個(gè)SNP標(biāo)記。

2.2" KASP位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)

使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer3（版本：2.4.0）對(duì)每個(gè)SNP標(biāo)記進(jìn)行KASP引物設(shè)計(jì)，轉(zhuǎn)化為KASP標(biāo)記，對(duì)引物設(shè)計(jì)成功的9 148個(gè)標(biāo)記的分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖2）。主要分布在外顯子和內(nèi)含子，分別占27.5%和34.1%，基因間區(qū)域占16.5%。

每隔2 Mb選取1個(gè)標(biāo)記，保證標(biāo)記在染色體上均勻分布，共開(kāi)發(fā)50個(gè)SNP標(biāo)記，SNP標(biāo)記位置與等位基因如表2所示。

2.3" KASP分型與指紋圖譜構(gòu)建

將基因分型結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果（圖3）顯示，50個(gè)標(biāo)記中，有23個(gè)標(biāo)記能夠成功分型19份厚皮甜瓜資源（其中Ks-7和Ks-15親緣關(guān)系近，開(kāi)發(fā)的50個(gè)SNP均不能將2個(gè)資源分型，最終結(jié)果顯示時(shí)將Ks-15剔除，保留Ks-7的數(shù)據(jù)）。將這23個(gè)標(biāo)記用于遺傳背景分析和指紋圖譜構(gòu)建，其中Marker33、Marker38、Marker23、Marker36、Marker47、Marker42 6個(gè)標(biāo)記可以區(qū)分所有種質(zhì)資源，可以用來(lái)構(gòu)建最少標(biāo)記的核心指紋圖譜。

2.4" 遺傳背景分析

使用MEGA 7.0軟件根據(jù)基因分型結(jié)果對(duì)19份厚皮甜瓜材料構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖4。Ks-7、Ks-12、Ks-16和Ks-20被聚類(lèi)在一個(gè)分支上，說(shuō)明這4個(gè)品種的遺傳關(guān)系相近，其中Ks-7、Ks-12和Ks-16均為白皮甜瓜，Ks-20為黃皮甜瓜。由圖4可以看出，Ks-1、Ks-3、Ks-5、Ks-8、Ks-9、Ks-11、Ks-13、Ks-17和Ks-19屬于一個(gè)分支，除了Ks-8，其他均為脆肉甜瓜。Ks-2、Ks-4、Ks-6、Ks-10、Ks-14和Ks-18被聚類(lèi)到一個(gè)分支，均為軟肉甜瓜。

品種編號(hào)信息見(jiàn)表1。

3" 討論

作物育種經(jīng)歷了原始選育、傳統(tǒng)育種和分子標(biāo)記輔助育種3個(gè)階段，原始選育和傳統(tǒng)育種極度依賴(lài)種質(zhì)資源和育種家經(jīng)驗(yàn)的隨機(jī)組合，受主觀因素影響較大，效率較低，目前中國(guó)在分子標(biāo)記輔助育種和轉(zhuǎn)基因育種研究中都有較大的進(jìn)展。豐富的遺傳變異給育種者提供了大量的資源，在資源利用過(guò)程中由于轉(zhuǎn)基因涉及多種因素，分子標(biāo)記成為利用基因功能輔助作物育種的主要手段之一。SNP分子標(biāo)記以其高密度、遺傳穩(wěn)定、二等位遺傳等優(yōu)點(diǎn)，成為高通量、自動(dòng)化的標(biāo)記而被廣泛應(yīng)用。用于高通量SNP檢測(cè)的KASP技術(shù)具有成本低、高通量、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)，成為作物遺傳改良的一項(xiàng)基準(zhǔn)技術(shù)。本研究通過(guò)公布的甜瓜基因組和95份厚皮甜瓜種質(zhì)資源重測(cè)序數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)覆蓋全基因組的SNP，經(jīng)過(guò)變異檢測(cè)和功能注釋后篩選出高質(zhì)量、代表性強(qiáng)的50個(gè)SNP標(biāo)記，在基因組上分布均勻、特異性強(qiáng)，其中有23個(gè)標(biāo)記能夠?qū)?9份核心厚皮甜瓜種質(zhì)資源進(jìn)行分型，其中6個(gè)標(biāo)記可以區(qū)分所有種質(zhì)。

中國(guó)厚皮甜瓜的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)是西北地區(qū)，20世紀(jì)90年代東部地區(qū)開(kāi)始利用保護(hù)地種植甜瓜，所以甜瓜產(chǎn)區(qū)東移，以江蘇省為例，甜瓜年種植面積約2×104 hm2，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的江蘇省甜瓜品種的栽培比例約占30%。一套成熟的甜瓜KASP分子標(biāo)記不但能夠構(gòu)建資源和品種的指紋圖譜，也能成為純度鑒定的有效手段，避免在資源收集和整理過(guò)程中出現(xiàn)重復(fù)保存和混淆的狀況，通過(guò)開(kāi)發(fā)的標(biāo)記，能夠準(zhǔn)確快速地將親本資源進(jìn)行分類(lèi)和純度鑒定。本研究中Ks-7和Ks-15在資源整理和應(yīng)用過(guò)程中表型存在一定的差異，但是使用開(kāi)發(fā)的50個(gè)KASP標(biāo)記均不能將其分型。另外，通過(guò)對(duì)甜瓜資源的進(jìn)化分析可以明確不同資源之間的遺傳關(guān)系，本研究中19份甜瓜種質(zhì)資源分為3個(gè)分支，說(shuō)明此核心種質(zhì)資源的遺傳較為豐富，Ks-1和Ks-19均為白皮紅脆肉類(lèi)型的厚皮甜瓜資源，但是遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，在組合配置的時(shí)候可以作為不同類(lèi)別甜瓜的核心親本使用。

種子純度關(guān)乎種子安全，種子上市之前最為關(guān)鍵的步驟就是鑒定種子純度，常規(guī)大田鑒定對(duì)于時(shí)間和空間的要求較高，每年秋季有大量西甜瓜種子生產(chǎn)企業(yè)前往云南省元謀縣進(jìn)行大田鑒定，耗時(shí)耗力。多個(gè)蔬菜作物的SNP標(biāo)記已經(jīng)被應(yīng)用，如大白菜、西蘭花、豇豆、西瓜、番茄和辣椒等，但是厚皮甜瓜乃至甜瓜中KASP標(biāo)記鑒定純度的報(bào)道較少。

4" 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)95份已經(jīng)公布的厚皮甜瓜重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出23個(gè)SNP標(biāo)記，能夠?qū)⒈狙芯恐械?9份核心厚皮甜瓜種質(zhì)資源進(jìn)行分型，其中Marker33、Marker38、Marker23、Marker36、Marker47、Marker42 6個(gè)標(biāo)記能夠完全區(qū)分19份甜瓜種質(zhì)資源，并分析了育種材料之間的遺傳背景，構(gòu)建了指紋圖譜。在本研究中，SNP標(biāo)記的開(kāi)發(fā)可為厚皮甜瓜分子標(biāo)記輔助育種、甜瓜資源快速鑒定分類(lèi)、雜種種子純度鑒定和指紋圖譜構(gòu)建提供技術(shù)支撐。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）