基于SRAP分子標記的華頂杜鵑遺傳多樣性

吳 倩,湯紫依,田盛野,何海葉,潘偉偉,王軍峰,鮑洪華,張慧娟,蔣 明,*

(1.臺州學院 生命科學學院,浙江 臺州 318000; 2.華東藥用植物園科研管理中心,浙江 麗水 323000; 3.臺州市生態環境保護局路橋分局,浙江 臺州 318050)

杜鵑花屬(Rhododendron)是杜鵑花科(Ericaceae)最大的一個屬,約有1 200多個物種,主要分布于大洋洲、美洲、歐洲和亞洲,在北極也有分布,但種類很少,僅2種,分別為杜鵑亞屬(Subgen.Rhododendron)的高山杜鵑(R.lapponicum)和云間杜鵑亞屬(Subgen.Therorhodion)的堪察加杜鵑(R.camtschaticum)[1-2]。我國有720余種野生杜鵑花屬植物,主要集中在華南和西南地區;浙江的杜鵑花屬物種數量相對較少,僅19種,如羊躑躅(R.molle)、云錦杜鵑(R.fortunei)、馬銀花(R.ovatum)和華頂杜鵑(R.huadingense)等[3-4]。華頂杜鵑是丁炳揚等[5]于1990年在浙江省天臺縣天臺山華頂發現的新物種,它生于海拔700～1 200 m的針闊葉混交林中,株高1～4 m,樹皮呈斑塊狀縱裂。華頂杜鵑的花期較長,開花時無葉,花色艷麗,花瓣上有橙紅色的斑點;新葉綠中帶紅,色澤鮮明,具有較好的觀賞價值(圖1)。華頂杜鵑的植株十分稀少,分布區域十分狹窄,該物種已被列入國家Ⅱ級和浙江省重點保護野生植物名錄。近年來的研究發現,華頂杜鵑種間關系松散,整體關聯性差,種群存在著不同程度的衰退現象,該物種亟需保護[6-7]。

A,花;B,新生枝條。A, Flowers; B, Newborn branches.圖1 華頂杜鵑Fig.1 Rhododendron huadingense

遺傳多樣性是指一個物種居群間、居群個體間遺傳差異的總和,體現物種對環境的適應能力,通常多樣性越高,適應能力越強[8]。分子標記是以DNA多態性為基礎的遺傳標記方法,與形態學標記、細胞學標記和生化標記相比,分子標記不受外界環境因素的影響,具有穩定性好、重復性高的優點。分子標記是研究遺傳多樣性的重要工具,已廣泛應用于基因圖譜構建、種質資源鑒定和遺傳多樣性評價等[9]。相關序列擴增多態性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)是一種基于PCR的新型分子標記技術,以復性變溫法為核心,利用特定引物擴增開放閱讀框(open reading frame, ORF)。相比簡單序列重復區間(inter-simple sequence repeat, ISSR)、隨機擴增DNA多態性(random amplified polymorphic DNA, RAPD)、簡單重復序列(simple sequence repeat, SSR)等分子標記,SRAP具有共顯性高、重復性好、操作簡便等優點,被廣泛應用于種質資源鑒定評價、基因定位克隆、遺傳多樣性分析等方面的研究[10-11]。近年來,華頂杜鵑相關研究主要集中在群落結構、種子萌發與育苗等方面,在分子層面的研究較少,未見采用SRAP分析華頂杜鵑遺傳多樣性的報道。本研究利用SRAP分子標記,對不同居群華頂杜鵑的遺傳多樣性進行分析,為開展該珍稀植物的保護和合理利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

葉片樣品采自華頂杜鵑的5個居群,分別為天崗尖(TGJ)、道場磯(DCJ)、池澡(CZ)、括蒼山(KCS)和天臺山(TTS),經緯度和海拔等信息如表1所示。采集華頂杜鵑不同植株的葉片,共50份樣品,裝入自封袋后帶回實驗室。葉片先用大量的自來水沖洗,再用無菌水沖洗多次,以去除表面的異物。葉片晾干后保存在-80 ℃冰箱,用于基因組DNA的提取。

表1 不同居群華頂杜鵑的地理信息

1.2 基因組DNA的提取

取2 g葉片,置于無菌研缽中,加入液氮后用研棒迅速磨成粉末。粉末轉移至1.5 mL離心管中,采用十二烷基磺酸鈉法(SDS法)提取華頂杜鵑葉片基因組DNA。取5 μL用于電泳檢測,剩余DNA溶液分裝后放入-20 ℃冰箱保存備用。

1.3 SRAP-PCR擴增

PCR反應體系：2 μL 10× PCR緩沖液、0.5 μL dNTPs(10 mmol·L-1)、上/下游引物(20 μmol·L-1)各0.45 μL、DNA模板0.7 μL(30 ng·μL-1)、0.9 μLTaq酶(2 U·μL-1)和ddH2O 15 μL。利用這一體系,從140對引物中篩選重復性好、多態性高的組合,用于SRAP-PCR擴增。SRAP-PCR擴增程序設置為：94 ℃ 5 min;隨后進入首個循環,包括94 ℃變性1 min,37 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共5次;94 ℃預變性1 min然后進入下一個循環,該循環包括94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共35次;循環結束后,72 ℃最后延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳,電泳結束后拍照記錄。

1.4 數據統計

分別以“0”與“1”表示條帶的缺失和存在,用Excel構建0/1矩陣。將SRAP-PCR的統計結果導入Popgene32軟件,計算居群水平和物種水平的遺傳參數。利用軟件NTSYS 2.10進行UPGMA聚類分析;用OriginPro軟件進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 SRAP引物的篩選

總共篩選到8個引物組合,分別是ME 2/em 6、ME 3/em 6、ME 3/em 14、ME 4/em 11、ME 4/em 14、ME 4/em 17、ME 5/em 4、ME 8/em 1(表2)。利用這些引物擴增得到的條帶清晰度高、穩定性好、多態性豐富,可用于后續的讀帶和統計分析(圖2)。

表2 SRAP引物組合

M,DNA標準分子量;A～D,池澡、天崗尖、道場磯和括蒼山樣地;1～10,10個樣品。M, DNA marker; A-D, Sampling sites of CZ, TGJ, DCJ and KCS; 1-10, Ten samples.圖2 ME5/em4引物的PCR擴增產物Fig.2 PCR products using ME5/em4 primer pairs

2.2 居群間的遺傳多樣性分析

利用8對引物共擴增出263個位點,其中多態性位點261個,多態位點百分率為99.24%,平均每對引物擴增出32.87個位點(表3)。觀測等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(H)和Shannon's信息指數(I)如表3所示。物種水平上,華頂杜鵑的H為0.221 5,I為0.357 9,而居群水平的PPB均值為36.96%,I與H的均值分別為0.181 7和0.119 9,數據低于物種水平。各居群的遺傳參數也存在較大的差異,KCS的遺傳參數(Na、Ne、H、I)都大于其他居群,具有較高的遺傳多樣性。

表3 華頂杜鵑居群的遺傳多樣性

2.3 居群間的遺傳結構分析

各居群間遺傳距離范圍為0.116 7～0.217 3,平均遺傳距離為0.156 7,其中KCS和CZ的遺傳距離最大,為0.217 3,遺傳一致度最小,為0.804 7,說明居群間存在較大的遺傳差異,它們的關系較遠;DCJ與CZ的遺傳距離最小,為0.116 7,遺傳相似系數最大,為0.889 9,表明2個居群的遺傳差異性最小(表4)。遺傳分化系數(Gst)和基因流(Nm)的計算結果表明,5個居群間的Gst為0.459 6,即遺傳變異中有45.96%來自于居群間,54.04%存在于居群內;Nm為0.587 8,該值小于1,表明居群間的遺傳交流少。

表4 華頂杜鵑4個居群的遺傳距離與遺傳一致性

2.4 聚類分析

聚類分析結果顯示,遺傳相似系數為0.31時,5個居群聚為2個不同的分支,第一支包括居群TGJ、KCS和TTS,另一支包括居群DCJ和CZ,表明DCJ、CZ與其他3個居群間的關系相對較遠;隨著相似系數的升高,居群個體間的遺傳關系更加明確,同一地理來源的樣品聚為一組,居群之間沒有任何交叉。遺傳相似系數約為0.56時,TTS居群的10個樣品被分為兩支,TTS3單獨聚于一支,說明TTS3與該居群內其他個體間存在一定的差異(圖3)。利用OriginPro軟件進行主成分分析,結果表明,來自5個不同居群的50個樣品可分為5組,每組10個樣品,與聚類分析的結果一致(圖4)。

TGJ,天崗尖;DCJ,道場磯;CZ,池澡;KCS,括蒼山;TTS,天臺山。TGJ, Tiangangjian; DCJ, Daochangji; CZ, Chizao; KCS, Kuocangshan; TTS, Tiantaishan.圖3 華頂杜鵑5個居群的UPGMA聚類圖Fig.3 Dendrogram of 5 Rhododendron huadingense populations based on UPGMA

圖4 華頂杜鵑居群的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of Rhododendron huadingense populations

3 結論與討論

遺傳多樣性是評判物種進化潛力和適應能力的依據,遺傳多樣性水平越高,物種內所含的等位基因就越豐富,適應環境能力越強,進化潛能越大[12]。通常廣布種的遺傳多樣性水平較其他物種高,但也有研究表明,一些窄域種、瀕危種或特有種的遺傳多樣性水平高于廣布種。由永飛等[13]利用SRAP分子標記分析瀕危植物金毛狗(Cibotiumbarometz)的遺傳多樣性,結果顯示,其物種水平多態性百分率為85.98%,具有較高的遺傳多樣性水平。葉興壯等[14]對瀕危植物半楓荷(Semiliquidambarcathayensis)進行研究,發現其遺傳多樣性水平遠高于部分廣布種。王長林等[15]利用SRAP分子標記研究珍稀瀕危植物明黨參(Changiumsmyrnioides)10個居群的遺傳多樣性,發現其多態性位點百分率為86.50%,顯示了較高的遺傳多樣性。本研究也得到了類似的結果,在物種水平上,華頂杜鵑的PPB值高達99.24%,I值為0.357 9,H值為0.221 5,高于許多瀕危的灌木物種,而居群水平上的遺傳參數遠小于物種水平,表明華頂杜鵑居群內個體的遺傳變異水平相對較低。

植物種群的遺傳變異主要受到種群大小、繁育系統、基因流等因素的影響,其中基因流的遷移可以防止種群分化,阻止種群內遺傳變異的減少[16]。植物的基因交流需要依靠花粉、孢子等攜帶遺傳物質的媒介,而華頂杜鵑的繁育系統為異交,可以通過種子或花粉的擴散進行居群間和居群內基因的交流[17]。任雪鋒等[18]對異花授粉植物狗牙根(Cynodondactylon)進行遺傳多樣性研究,結果顯示,狗牙根居群間的遺傳分化系數為0.385 7,說明其居群內存在頻繁的雜交現象,而居群間的基因交流受到地理隔絕的限制。槭屬(Acer)植物青榨槭(A.davidii)種群內存在一定程度的自交和近交,加之生境片段化的影響,使得居群間的遺傳分化水平較低[19]。本研究中,華頂杜鵑居群間的遺傳分化系數為0.459 6,表明遺傳變異大部分出現在居群內,其余發生在居群間。Wright[20]研究發現,當Nm<1時,遺傳漂變會導致種群間發生明顯的遺傳分化。華頂杜鵑Nm為0.587 8,說明居群間發生了遺傳漂變,它是居群間發生遺傳分化的重要原因之一。

本研究在野外采樣、基因組DNA提取、引物篩選的基礎上,利用SRAP分子標記明確了華頂杜鵑的遺傳多樣性,為后續開展華頂杜鵑的保護和合理利用提供了依據。