不同株齡魯菏紅細根內生微生物群落變化特征

喬紅雍,袁 濤,*,趙信勇,楊會巖

(1.北京林業大學 園林學院,花卉種質創新與分子育種北京市重點實驗室,國家花卉工程技術研究中心,城鄉生態環境北京實驗室,林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室,北京 100083; 2.曹州牡丹園,山東 菏澤 274000)

內生微生物包括細菌、真菌等,它們與植物共生,是植物微生態系統重要組成部分,通過調節營養物攝取或產生各種次生代謝產物影響植物生長[1-3]。除地域差異、養護水平等外界因素影響外[4-5],內生微生物還受植株組織部位、生長階段等自身因素影響[6-8]。與植物葉、莖等不同組織微生物相比,根內生微生物與根際土壤微生物相似,能更迅速響應土壤微環境變化。根內生微生物加強了土壤微生物與根系特定的分泌物之間的分子交換作用,通過誘導系統抗性來幫助植物抵抗干旱、高溫等非生物脅迫[9-10]以及病原菌對植物的生物脅迫[11-12],從而促進植物的健康生長。

雖然有部分論文開展了牡丹(Paeoniasuffruticosa)根際土壤微生物相關研究,但有關牡丹植株內生微生物的研究較少,仍處于初步階段。研究者起初利用培養法開展牡丹內生微生物相關研究,例如,何建清等[13]初步篩選了大花黃牡丹(Paeonialudlowii)的內生菌,分離獲得1株具有抑菌廣譜性、活性強的鏈霉菌屬菌株。從牡丹根部分離得到的蘇云金芽孢桿菌、假真菌樣芽孢桿菌對牡丹灰霉病原菌具有顯著的抑制作用[14]。鄭艷等[15]和劉雪停等[16]從牡丹植株組織內分離得到用來對根結線蟲、青霉和鏈格孢霉菌等病原菌有一定拮抗作用的內生微生物。由于培養法不能從整體上認識植物內生微生物,因此研究牡丹內生微生物也可采用高通量測序技術。不同品種間牡丹根部和葉片內生細菌群落分布不盡相同,且葉片中的部分內生細菌來自根部[17]。大花黃牡丹不同組織(根、莖、葉、花和果實)內生真菌也有一定差異,根中共獲得6個門水平分類,其中相對豐度>1%的分別為子囊菌門、擔子菌門(Basidiomycota)和被孢霉門(Mortierellomycota),莖中有3個門,與根部內生真菌接近,而果實、花、葉中僅有子囊菌門和擔子菌門2個門[18]。在四川牡丹(Paeoniaszechuanica)種子內生微生物的研究中,變形菌門、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、厚壁菌門(Firmicutes)、酸桿菌門和綠彎菌門(Chloroflexi)是其最主要的5種細菌門類,子囊菌門和毛霉門(Mucoromycota)是其主要真菌門類[19]。

課題組在與多年種植的專類觀賞園或種質資源苗圃的合作中發現,隨著牡丹株齡的增長,長勢逐漸衰弱,開花量減少,花小而色淡,易感病牡丹比率增多,且不易防治,容易出現大量植株死亡的現象。由于細根內生微生物會顯著影響植株的生長發育[1-3],且與植物本身的生長階段密切相關[6-8],但還未見關于株齡對牡丹細根內生微生物影響的相關研究,因此本文以牡丹品種魯菏紅為代表,利用16S rDNA和ITS序列Illumina Miseq測序技術分別對5、12、20和30年4種株齡牡丹細根內生微生物進行了研究,旨在探索不同株齡牡丹內生微生物群落的潛在變化規律,以及細根的生理生化特征及其對根內生微生物的影響。本研究有助于豐富牡丹內生微生物的種類和資源,為挖掘可培養微生物資源、保持牡丹健康生長和預防根部疾病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2021年9月,在山東省菏澤市曹州牡丹園(115°30′ E,35°17′ N)選擇株齡分別為5(ART1)、12(ART2)、20(ART3)和30年(ART4)牡丹品種魯菏紅 (Paeoniasuffruticosacv. Lu He Hong)為研究對象(表1),從植株東西南北4個方向收集0～20 cm土層的細根樣品,即最末端的吸收根,白色,直徑≤ 2 mm[20],每株混合成一份,每一株齡隨機選擇6株作為生物學重復,共24份保存于-80 ℃,用于后續生理生化指標和內生微生物檢測。

表1 不同株齡魯菏紅基本信息

魯菏紅為山東省菏澤市趙樓牡丹園(現曹州牡丹園)于1968年育成的中原牡丹品種[21]。花紅色,花形為千層臺閣型。易開花、生長健壯、適應性強,且株態勻稱端莊,是當地栽培應用較多的品種。

1.2 細根理化性質測定

可溶性糖、纖維素含量采用蒽酮-硫酸比色法測定;可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G250比色法測定;丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定[22];超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法測定;過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚法測定;過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法測定;根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定[23]。

1.3 細根內生微生物DNA提取、PCR擴增和Illumina測序

將采集的細根用無菌水在超聲波條件下沖洗3次,70%乙醇浸泡10 min后用無菌水再次清洗3次得到無菌根樣品,使用Fast DNA spin kit for soil(MP Biomedicals LLC, USA)提取根DNA,流程按照說明書進行。細菌引物515F(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′)、806R(5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′)[24],真菌引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[25]、ITS7(5′-GTGARTCATCGARTCTTTG-3′)[26]擴增提取DNA樣品,PCR擴增體系(50 μL)和反應體系參考吳璐瑤等[27]的研究,不同的是循環次數均增加了5個。NanoDrop 2000(Thermo)微量紫外分光光度計檢測DNA濃度,等量混合(150 ng DNA/樣品)后送廣州美格生物基因科技有限公司Illumina Miseq平臺測序。測序原始數據均已上傳至NCBI的SRA數據庫(內生細菌和內生真菌的登錄編號分別為PRJNA899358和PRJNA899796)。

測序結果上傳至Galaxy在線分析平臺(http：//mem.rcees.ac.cn：8080)[28],再根據引物標簽區分原始數據,用FLASH合并上下游引物,用Btrim過濾序列,保留>20 bp序列的同時刪除<200 bp序列,Trim保留最小序列245 bp,刪除最大序列細菌260 bp/真菌350 bp。最后使用UPARSE去掉系列中的嵌合體,OTU的相似度閾值97%[27],16S rDNA和ITS分別使用核糖體數據庫和Silva數據庫進行物種注釋。

1.4 統計分析

2 結果與分析

2.1 細根生理生化特征

隨株齡增加(表2),纖維素含量、POD和CAT活性逐年顯著增加,而可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、根系活力和SOD活性變化規律基本一致,呈現不同程度地先增加后減少(P<0.05),在ART4降到最低。MDA含量也是先增加后減少,但ART4的MDA含量依然比ART1高。

表2 不同株齡魯菏紅細根生理生化指標

2.2 細根內生微生物群落

2.2.1 細根內生微生物組成

因樣本間序列差異較大,所有樣本均隨機重新抽樣到相同序列深度(內生細菌43 628個序列,內生真菌29 206個序列)后分析,序列被聚類為4 994個和1 485個OTUs。由圖1可知,4種株齡牡丹根共有內生細菌和內生真菌OTUs分別為540個和469個。當株齡達到30年時,ART4處理真菌OTUs總數和特有OTUs占比最多,分別占70.37%和17.10%;ART1處理細菌OTUs總數和特有OTUs占比最多,分別占52.52%和22.37%,隨株齡的增加,兩者均是先急劇減少后逐步增加。

a, 細菌;b,真菌。a, Bacteria; b, Fungi.圖1 不同株齡魯菏紅細根內生微生物OTUs Venn圖Fig.1 Endophytes OTUs Venn diagram of Lu He Hong fine-roots in different plant ages

對不同株齡魯菏紅內生微生物群落豐度和多樣性指數比較后可知(表3),雖然Chao1、Shannon、Simpson指數呈現不同程度的變化,但差異均不顯著。

表3 不同株齡魯菏紅細根內生微生物群落豐度和多樣性

由圖2-a可知,4種株齡魯菏紅細根內生細菌相對含量>1%的門水平均為藍細菌門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和酸桿菌門(Acidobacteria)。內生細菌均以藍細菌門最高,含量在78.54%～90.00%。株齡20年魯菏紅細根放線菌門和擬桿菌門含量顯著高于幼齡植株,隨著株齡的增加又顯著減少。酸桿菌門隨株齡的增加緩慢增加,其相對含量在株齡30年后顯著高于5年植株。

a, 細菌;b, 真菌。a, Bacteria; b, Fungi.圖2 不同株齡魯菏紅細根內生微生物門水平組成Fig.2 Composition of endophytes phylum in different plant ages of Lu He Hong fine roots

a,細菌;b,真菌。一個節點(node)代表一個OTU;節點顏色代表門水平分類,節點大小代表其連接數;每條線代表與其相連的兩個節點間的相關性,橙色代表負相關,綠色代表正相關。a, Bacteria; b, Fungi. A node represents an OTU; The color of nodes represents phylum level classification, and the size of nodes represents the number of connections; Each line represents a correlation between two nodes connected to it, with orange representing a negative correlation and green representing a positive correlation.圖3 不同株齡魯菏紅細根內生微生物分子網絡Fig.3 Molecular network of endophytes in different plant ages of Lu He Hong fine roots

由圖2-b可知,4種株齡魯菏紅細根內生真菌均屬于5個門水平(除未分類門外),3個門的相對豐度≥1%,分別為子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和球囊菌門(Glomeromycota)。魯菏紅細根內生真菌均以子囊菌門占絕對優勢,高達93.99%～96.14%,但不同株齡間差異不顯著。

2.2.2 魯菏紅細根內生微生物功能預測

采用PICRUSt2軟件預測魯菏紅細根內生細菌功能,共獲得新陳代謝(metabolism)、遺傳信息處理(genetic information processing)和環境信息處理(environmental information processing)為主的6類一級功能層生物代謝通路,占比分別為66.03%～66.60%、18.11%～18.44%和10.53%～10.92%(表4)。魯菏紅細根內生細菌的功能占比僅環境信息處理在株齡10年后顯著降低,其余5類一級功能層預測基因并無明顯變化。

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表4 不同株齡魯菏紅細根內生微生物預測功能占比

魯菏紅細根內生真菌FUNGuild的功能預測中,將Saprotroph-Symbiotroph、Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph、Pathotroph-Saprotroph、Pathotroph-Symbiotroph合并為混合營養型(Mixture),因此獲得腐生營養型(Saprotroph)、病理營養型(Pathotroph)、共生營養型(Symbiotroph)和混合營養型4種營養模式,占比分別為4.77%～21.19%、46.42%～86.60%、1.62%～18.20%和4.02%～14.18%(表4),不同株齡均以病理營養型真菌為主。腐生營養型和混合營養型變化一致,在株齡12年顯著減少,之后保持在低水平的相對含量下基本不變。而病理營養型變化規律正好與其相反,在株齡12年時大幅度顯著增加,之后一直保持在較高水平,說明隨株齡的增加,潛在致病真菌增多。

2.3 魯菏紅細根內生微生物結構與生理生化指標關系

基于Jaccard距離分析魯菏紅細根內生微生物群落結構,并結合細根生理生化指標Mantel分析,結果如表5所示,細根生理生化指標僅纖維素含量、POD和CAT活性顯著影響內生細菌群落結構。

表5 魯菏紅細根內生微生物群落結構與生理生化指標的Mantel相關性分析

2.4 魯菏紅細根內生細菌和真菌分子網絡

本研究在相同閾值水平(細菌0.93;真菌0.96)比較不同株齡牡丹細根內生微生物群落的拓撲性質,結果如表6所示。4種株齡魯菏紅細根內生微生物群落的網絡連接性分布符合冪律模型,微生物域內網絡與其對應的隨機網絡的聚類系數、平均距離和模塊化差異極顯著,說明域內網絡間的相互連接具有顯著的確定性意義,表現為模塊化屬性。

表6 不同株齡魯菏紅細根內生微生物實證網絡的拓撲結構與隨機網絡比較

模塊內連接性和模塊間連接性構成了拓撲角色,并將其分為模塊中心點、網絡中心點、外圍節點和連接節點[31],其中網絡中心點、模塊中心點與各自模塊內的許多連接節點高度連接,可以視為整個網絡中的關鍵物種[29]。在展示4種株齡內生微生物群落拓撲角色分布圖中(圖4),大部分為外圍節點,且均無網絡中心點。ART1內生細菌中共有9個模塊中心點(變形菌門5個,藍細菌門、放線菌門、擬桿菌門和酸桿菌門各1個),3個連接節點(變形菌門3個、放線菌門1個);內生真菌中有6個模塊中心點(子囊菌門4個、未分類門2個),2個子囊菌門位于連接節點。ART2內生細菌中共有3個模塊中心點(奇古菌門1個、藍細菌門2個),1個連接節點為變形菌門,內生真菌中有7個模塊中心點(子囊菌門4個、未分類門3個),僅有1個子囊菌門屬于連接節點。ART3內生細菌中共有8個模塊中心點(變形菌門3個,放線菌門2個,擬桿菌門、藍細菌門和綠彎菌門各1個),6個連接節點(變形菌門3個,藍細菌門、浮霉菌門和酸桿菌門各1個)。同理,ART4內生細菌中共有8個模塊中心點(變形菌門4個、擬桿菌門2個、未分類門2個),2個連接節點(奇古菌門和酸桿菌門各1個);內生真菌中僅4個模塊中心點(子囊菌門3個、球囊菌門1個)。雖然4種株齡魯菏紅細根內生細菌的關鍵菌種主要為變形菌門,但這些菌群負相關關系占比分別為43.59%、58.86%、36.8%和53.75%,株齡12年和30年魯菏紅細根內生細菌相互競爭作用更強烈。ART1、ART2和ART4中子囊菌門與其他真菌聯系更密切,在它們的互作關系中,正相關關系略高于負相關關系,占比分別為55.95%、50.91%、55.89%和53.86%,正相關關系和平均度隨株齡的增加先減少后增加再減少,因此隨牡丹株齡的增加,內生真菌間的正相關關系減弱。

a, 細菌;b, 真菌。a, Bacteria; b, Fungi.圖4 不同株齡魯菏紅細根內生微生物模塊節點的拓撲角色分布Fig.4 Module nodes topology role distribution of endophytes in different plant ages of Lu He Hong fine roots

3 討論

Yang等[17]對洛陽國家牡丹園中牡丹品種雪蓮、洛陽紅、Kaoh、High Noon、Kinkaku根內生細菌的研究中,分別獲得3 452、1 917、1 721、2 118和1 152個OTUs,少于本研究中魯菏紅細菌樣本4 994個OTUs。同樣,本研究中4種株齡魯菏紅細根內生細菌相對含量>1%的門水平分類均為藍細菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和酸桿菌門,而Yang等[17]的研究中5個牡丹品種的根內生細菌優勢類群由變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、酸桿菌門和放線菌門組成。結果的差異可能是由于牡丹品種、株齡或采樣地不同等因素造成的,但從Yang等[17]的研究中未獲得各牡丹品種的株齡和根樣品類別相關信息。兩個研究明顯不同的是本研究中藍細菌門占據了主導地位,但小麥根內也發現了藍細菌門占主導地位[32]。本研究中內生細菌OTUs數量隨株齡的增加,先急劇減少后逐步增加,內生真菌在株齡30年時才明顯增加,但豐富度和群落多樣性均未發生明顯變化。但在其他植物中,例如霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)的內生細菌多樣性隨生長年限的增加逐漸增大,但內生真菌多樣性指數基本不變[33];木麻黃(Casuarinaequisetifolia)根(直徑約1.5 cm)內生細菌的多樣性中以中齡林最高,成熟林次之,幼齡林最低。因此,植物種類對內生微生物多樣性的影響各不相同,可能與株齡、土壤理化性質及化感物質的積累等因素有關[34]。

幼齡林和成熟林的木麻黃根內生細菌在門水平上主要為變形菌門和厚壁菌門;而中齡林占主導地位為變形菌門和放線菌門[34]。因此,根內生微生物群落結構受植物發育階段的影響,在植物生長初期的營養生長階段變化顯著,到生殖階段后趨于穩定[6],本研究中牡丹均在生殖階段,但也隨株齡的增加發生相應變化。放線菌門可以通過產生生長素或控制各種植物病原體等作用來促進植物生長,擬桿菌門能夠直接參與木質纖維素的降解為植物生長提供營養物質[35-36],魯菏紅在株齡20年時,這兩種內生細菌含量顯著高于幼齡植株。當株齡增加到30年后,放線菌門和擬桿菌門的含量又顯著小于20年,表明株齡20年后魯菏紅細根微環境不利于牡丹生長。同時,牡丹細根中酸桿菌門相對含量隨株齡的增加緩慢增加,在株齡達到30年時顯著高于幼齡植株,也不利于牡丹生長[37-38]。

植物體內POD、CAT等抗氧化酶可維持植物體內活性氧代謝的平衡[39],其活性增加說明植物生存條件受到脅迫,魯菏紅細根中POD和CAT活性會隨株齡的增加逐年顯著增加。同時POD能促進植物中某些碳水化合物轉化成木質素,從而也增加了大齡牡丹中的纖維素含量[40]。大量研究證實根部內生微生物來自土壤,同時土壤理化性質如有機質、有效磷、全氮含量等會影響根內生微生物群落[41-43],但有關POD活性、MDA含量等根生理生化指標對其內生微生物群落結構的研究較少。本研究發現,內生真菌群落結構不受這些生理生化指標影響,僅纖維素含量、POD和CAT活性顯著影響內生細菌群落結構,這3個指標的變化與魯菏紅內生細菌中放線菌門和擬桿菌門等有益細菌的減少以及酸桿菌門等病原菌的增加一致。

PICRUSt和FUNGuild分別是預測細菌和真菌生態功能的軟件,可根據標記基因測序圖譜預測細菌和真菌群落的功能潛力,相較于宏基因組研究成本低,預測結果也具有較高的可靠性[44-46]。對魯菏紅細根內生細菌的一級功能層分析中,均表現為新陳代謝功能占比最大,雖然隨株齡的增加,病原細菌得到積累,但此時魯菏紅仍未表現出明顯的病癥,其新陳代謝仍比較活躍。腐生營養型真菌可通過分解植物殘體等有機質,供植物吸收利用[47],株齡12年后的魯菏紅細根上這類真菌顯著減少,表明細根吸收和運輸養分的能力下降。同時病理營養型則顯著增加,在株齡20年和30年時其相對含量均高達84%,它們主要通過傷害植物細胞獲取營養[48],表明隨株齡的增加,潛在的致病真菌也在增多,致病風險隨之增加。除未分類的內生真菌外,4種株齡魯菏紅根中含量最高的均為子囊菌門,它一般充當分解者的作用,以腐生、寄生和共生的營養方式生存,分解植物殘體,但部分子囊菌也會導致植物發生根腐、莖腐等[49]。結合FUNGuild,可能是隨魯菏紅株齡的增加,一些有害的子囊菌得到富集。本研究分析了株齡對牡丹細根內生微生物功能的影響,但鑒于其預測的局限性,只是初步預測了相關內生微生物功能,后續應結合傳統的分離培養方法和宏基因組學準確分析長期種植條件下牡丹細根內生微生物的群落功能。

生態網絡分析法(ecological network analysis)將微生物間的相互作用關系可視化后,復雜的微生物群落結構得以簡單化[50]。不同株齡魯菏紅細根的內生微生物種類或數量的改變,導致了網絡大小和復雜度的不同變化。隨株齡的增加,增加了細根內生微生物間的相互競爭關系,減弱其網絡連接性,不利于牡丹持續健康生長。

4 結論

魯菏紅細根的內生細菌和內生真菌樣本分別被聚類為4 994和1 485個OTUs,其中,內生細菌相對豐度>1%的門水平分類均為藍細菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和酸桿菌門,株齡超過20年后放線菌門和擬桿菌門相對含量開始顯著減少,而酸桿菌門含量逐步增加;內生真菌相對豐度均以子囊菌門占絕對優勢,但不同株齡間差異不顯著,在內生真菌生態功能中,腐生營養型和混合營養型在株齡12年后顯著減少,而病理營養型則顯著增加。牡丹根中纖維素含量、POD和CAT活性會隨株齡的增加顯著增加,且顯著影響內生細菌群落結構,但對內生真菌群落結構影響不大。隨牡丹株齡的增加,加劇了內生微生物間的相互競爭關系,減弱其網絡連接性。綜上所述,牡丹在生長前期長勢逐漸增強,在株齡20年后開始長勢衰弱,易發生病害,應采取適當的復壯措施保證其持續健康生長。