西瓜蔗糖轉運蛋白SUT家族的鑒定及其在果實發育和逆境響應中的表達分析

壽偉松,王 鐸,沈 佳,許昕陽,張躍建,何艷軍

(浙江省農業科學院 蔬菜研究所,浙江 杭州 310021)

蔗糖是植物中糖的主要運輸形式,被分配到各種組織中以支持生長和儲存。蔗糖轉運蛋白(SUT,也稱為SUC)在蔗糖通過質膜從源組織向某些庫組織細胞的主動轉運中發揮重要的中介作用[1]。植物SUT屬于主要促進因子超家族(MFS),其特征在于定位在細胞質中,通常有12個跨膜結構域[2-3]。第一個SUT基因是在菠菜中鑒定的[4]。迄今為止,幾乎所有高等植物中都克隆了SUT基因的cDNA序列[5-6]。SUT家族在擬南芥[7]、水稻[6]、玉米[8]、楊樹[9-10]、可可[11]、梨[12]、高粱[13]和小麥[14]等物種中均已被鑒定,它們在這些物種中通常有3～9個成員,是一個小的基因家族。

植物SUT家族基因參與花粉萌發、果實成熟和乙烯生物合成等眾多生長發育過程,尤其在果實發育中發揮十分重要的作用[10,15-17]。將擬南芥AtSUT2在水稻中過量表達,提高了水稻籽粒中的蔗糖負荷,使轉基因水稻的籽粒比野生型大,產量得到提高[18]。水稻OsSUT家族成員與葉片、花藥和種子中的淀粉積累有關。OsSUT3與葉片和花藥中淀粉的積累有關。OsSUT1在淀粉積累、花粉育性、株高、蔗糖長距離轉運和種子萌發等方面發揮作用[19-20]。OsSUT4主要在葉片中表達,在生殖器官中未見明顯變化[21]。在轉基因番茄中,SUT與番茄中蔗糖轉運的延遲、果實大小和坐果能力的降低有關[9,22]。此外,SUT基因參與植物與共生體、病原體和真菌之間的各種生理過程[23-25]。耐熱水稻幼苗經高溫處理后,葉片中OsSUT1的表達顯著低于對照,而OsSUT2、OsSUT3和OsSUT5的表達顯著高于對照[19]。

西瓜是一種重要的葫蘆科植物,是世界上最受歡迎的夏季水果之一,對西瓜果實發育及抗逆相關基因的挖掘十分必要。因此,本研究對西瓜蔗糖轉運蛋白SUT基因家族進行了全基因組鑒定,分析了它們的系統發育關系、基因結構、染色體位置等,并研究了ClSUT基因啟動子中與逆境和激素相關的順式作用元件,最后利用轉錄組數據分析了ClSUT基因在不同時期的西瓜果實和非生物脅迫條件(干旱和鹽)下的表達特征,為今后ClSUT基因在西瓜果實發育和脅迫反應中的生物學功能研究奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 西瓜ClSUT基因的鑒定與序列分析

西瓜基因組和蛋白質序列均從CuGenDBv2(http：//cucurbitgenomics.org/)下載。從TAIR 10數據庫獲取擬南芥SUT的氨基酸序列,在CuGenDBv2中進行BlastP檢索,初步篩選出西瓜SUT家族的候選成員,同時,利用HMM軟件檢索西瓜SUT,結合兩種方法獲取的候選蛋白,去掉冗余后,使用Pfam數據庫分析(E值為1.08)SUT序列以確認MFS-2 (PF13347.6)結構域的存在。過濾掉沒有MFS結構域的候選蛋白,最后,使用ExPASy網站(http：//web.expasy.org/protparam)預測氨基酸長度、分子量(MW)和等電點(pI)。利用ProtComp v.9.0(http：//linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)預測蛋白的亞細胞定位。

1.2 多序列比對與系統發育分析

使用默認設置的MEGA7.0對擬南芥、水稻、西瓜的全長ClSUT序列進行了多序列比對,然后利用這些蛋白序列通過鄰接法(參數為N-J,自展值為1 000)構建進化樹,進行系統發育分析。

1.3 基因結構和染色體定位分析

利用TBTools軟件從西瓜CDS和基因組文件中提取西瓜ClSUT基因的CDS序列和相應的基因組序列,獲取西瓜ClSUT基因的外顯子/內含子結構。使用TBTools軟件從西瓜基因組注釋gff3文件中提取西瓜ClSUT基因位點,繪制染色體定位圖。

1.4 基因啟動子區順式作用元件分析

利用TBtools提取西瓜基因組中ClSUT基因上游2 000 bp的啟動子序列,上傳至PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent)中,并預測這些啟動子序列中包含的順式作用元件。

1.5 轉錄組數據分析

為了揭示研究西瓜ClSUT基因在果實不同發育時期的表達,利用Illumina HiSeq2000系統對野生類型西瓜PI296341-FR授粉后10、18、26、34、42、50 d(NCBI ID：PRJNA270773),和栽培類型西瓜材料97103授粉后10、18、26、34 d(DAP)(NCBI ID：SRP012849)的果實果肉進行RNA-seq分析。為了研究西瓜ClSUT基因在干旱(DS)和滲透(OS)脅迫下的表達譜,對干旱脅迫(4 d和8 d)和無干旱脅迫(4 d和8 d)的兩種基因型西瓜,Y34(干旱敏感)和M20(抗旱)葉片進行RNA-seq分析(NCBI ID：PRJNA454040)。同時,對西瓜根系對滲透脅迫響應進行轉錄組分析(PRJNA326331),利用ClSUT基因的ID號從CuGenDBv2數據庫檢索這些環境脅迫下的轉錄組數據。下載這些ClSUT基因歸一化的RPKM (reads per kilo bases per million mapping reads)值。最后,利用TBtools生成ClSUT基因在不同時期的果實和脅迫處理下的表達熱圖。

2 結果與分析

2.1 西瓜ClSUT基因家族成員的篩選

為了在全基因組范圍內鑒定西瓜中的SUT基因家族成員,利用擬南芥SUT序列在葫蘆科基因組數據庫(CuGenDBv2) 中進行了BlastP搜索,結果在西瓜中鑒定出4個SUT基因。使用HMM和Pfam進一步驗證了所有的SUT,篩選這些西瓜SUT含有高度保守的MFS結構域,最終確認了在西瓜整個基因組中共包含4個ClSUT基因。根據這些基因在染色體上的位置分別被命名為ClSUT1-ClSUT4(表1)。西瓜ClSUT1-ClSUT4基因編碼495～604個氨基酸,預測分子量從53.15 ku(ClSUT3)到64.78 ku (ClSUT2)不等,等電點(pI)范圍為5.67～9.36,其中ClSUT2(5.67)蛋白為弱酸性,pI小于7,其余pI均大于7,為典型的堿性蛋白。研究發現,甜菜和葡萄SUT的pI值都大于7,而部分西瓜和茄科作物的SUT呈弱酸性[26],這說明SUT基因的功能在不同的物種中呈現多樣化。

表1 西瓜ClSUT基因的基本信息

2.2 西瓜ClSUT基因的外顯子/內含子和蛋白結構分析

進一步利用Pfam在4個ClSUT中尋找保守的蛋白結構域(圖1),結果發現,所有的ClSUT均含有1個MFS-2 (PF13347.6) 結構域。同時,利用MEME分析在4個ClSUT中尋找保守基序,共獲得5個保守的蛋白基序(圖1-B),這些保守基序正對應了MFS-2結構域。為了進一步了解西瓜ClSUT的基因結構特征,對ClSUT家族成員的外顯子/內含子結構進行了分析,結果(圖2)顯示,ClSUT3和ClSUT4被聚類在同一亞族,它們均只含有一個內含子;而ClSUT1和ClSUT2分別含有4和13個內含子。通過ProtComp v.9.0預測ClSUT的亞細胞定位情況,結果發現,西瓜4個ClSUT均定位在質膜上,這與之前在其他物種中的報道相似[5-7,26]。基因結構、蛋白結構域和基序等方面的分析結果顯示,西瓜ClSUT基因相對保守。

A,西瓜ClSUT進化分析;B,西瓜ClSUT保守基序分析;C,西瓜ClSUT保守結構域分析。A, Phylogenetic tree of ClSUTs in watermelon; B, Conserved motifs of ClSUTs in watermelon; C, Conserved domains of ClSUTs in watermelon.圖1 西瓜ClSUT的進化、保守基序和結構域分析Fig.1 The phylogenetic, conserved motif, and domain analysis of ClSUTs in watermelon

圖2 西瓜ClSUT的基因結構Fig.2 The gene structure of ClSUTs in watermelon

2.3 西瓜ClSUT基因的序列比對和系統發育分析

為了進一步研究SUT的進化關系,利用擬南芥、水稻和西瓜的SUT序列構建進化樹,結果(圖3)顯示,所有的SUT被分為5個亞族,亞族Ⅰ的成員最多(9個),亞族Ⅳ中的成員最少(僅包含OsSUT5)。其中,亞族Ⅰ只包含來自雙子葉植物(擬南芥和水稻)中的SUT,西瓜ClSUT3和ClSUT4被聚類在這個亞族;AtSUT4、OsSUT2和ClSUT1聚類在亞族Ⅱ中;亞族Ⅲ和Ⅳ均僅包含來自水稻蛋白,亞族Ⅲ包括OsSUT1和OsSUT3,而亞族Ⅳ僅包含OsSUT5。亞族Ⅴ包括AtSUT3、OsSUT4和ClSUT2。

圖3 擬南芥、水稻和西瓜SUT的系統發育分析Fig.3 The phylogenetic analyses of SUTs in Arabidopsis, rice and watermelon

2.4 西瓜ClSUT基因的染色體定位

西瓜中4個ClSUT基因隨機分布在西瓜8、9和11這3條染色體上(圖4)。其中,ClSUT1和ClSUT2分別分布在8和9號染色體上,ClSUT3和ClSUT4基因均分布在11號染色體。本研究在西瓜ClSUT中未發現基因復制事件。

圖4 西瓜ClSUT基因的染色體定位Fig.4 The chromosomal localization of ClSUTs in watermelon

2.5 西瓜ClSUT基因啟動子順式作用元件分析

利用PlantCARE網站對西瓜ClSUT基因上游2 000 bp的啟動子序列上與激素和逆境相關的順式作用元件進行分析,預測發現了7個茉莉酸(MeJA)(TGACG-motif、TGACG-motif和CGTCA-motif)、3個生長素(TGA-element和AuxRR-core)、3個赤霉素(GARE-motif和P-box)、3個脫落酸(ABRE)響應元件;同時,還發現了4個厭氧(ARE)脅迫、2個低溫(LTR)和1個干旱(MBS)響應元件(圖5)。

圖5 西瓜ClSUT基因的啟動子順式元件分析Fig.5 The cis-elements in the promoters of ClSUTs in watermelon

2.6 西瓜ClSUT基因在果實發育的不同時期的表達特征

為了進一步了解ClSUT基因在西瓜果實發育中的作用,利用RNA測序(RNA-seq)數據研究了PI296341-FR西瓜授粉后10、18、26、34、42、50 d西瓜果實中ClSUT基因的表達譜。ClSUT基因在這些不同時期的果實中的FPKM表達水平用不同的顏色表示(圖6-A)。熱圖結果分析表明,ClSUT1和ClSUT2在不同時期的果實中的表達豐度(RPKM均一化值)較高,而ClSUT3和ClSUT4相對較低。ClSUT1的表達從授粉后10～26 d逐漸升高,然后從34 d開始降低;ClSUT2在整個的果實發育期的表達豐度都很高,在授粉后26 d的表達量達到峰值。ClSUT3僅在授粉后10 d檢測到微弱的表達(RPKM=1),其余發育時期均沒有檢測到表達。而ClSUT4僅在授粉后18 d檢測到表達(RPKM=1),在其余發育時期沒有表達。進一步利用栽培類型西瓜材料97103果實中的轉錄組數據研究了ClSUT基因在授粉后10、18、26、34 d的西瓜果實中的表達譜(圖6-B)。結果表明,ClSUT1的表達水平從授粉后10～34 d逐漸降低,ClSUT2在整個的果實發育期的表達豐度都很高,授粉后34 d的表達水平達到峰值;與PI296341-FR果實中的表達相似,ClSUT3和ClSUT4基本也沒有檢測到表達。

2.7 西瓜ClSUT基因對干旱和滲透脅迫的表達譜

通過轉錄組數據分析了西瓜ClSUT基因對滲透和干旱脅迫的表達特征,結果發現,在滲透(OS)和干旱脅迫(圖7-A)處理下,ClSUT3和ClSUT4在對照和處理后的葉片中幾乎都沒有被檢測到表達。滲透脅迫處理后,ClSUT1的表達水平顯著降低(RPKM值從5.81降低到2.89),ClSUT2的表達水平則沒有明顯變化。而干旱處理后4 d和8 d(圖7-B),ClSUT1在干旱敏感(Y34)和耐旱(M20)材料中的表達水平均有輕微上調;ClSUT2在處理后8 d的干旱敏感(Y34)基因型中的表達水平顯著上調了2.09倍,而在M20基因型中的表達水平沒有顯著變化。

CK,對照材料;OS,滲透脅迫下西瓜材料;Y34,干旱敏感西瓜材料;M20,抗旱西瓜材料。CK, Control; OS, Watermelon root tissue under osmotic stress; Y34, Non-drought resistant material; M20, Drought-resistant material.圖7 西瓜ClSUT基因在滲透(A)和干旱(B)脅迫下的表達水平熱圖Fig.7 The expression heatmap of ClSUT in different watermelon in response to osmotic (A) and drought (B) stress

3 結論與討論

蔗糖轉運蛋白SUT在植物中普遍存在,在植物生長、發育和抗脅迫中起著重要作用[15-17,27]。

迄今為止,已經在各種植物物種中鑒定出了SUT,包括擬南芥[16]、水稻[3,6]、玉米[8]、六倍體小麥[14]、楊樹[28]等,然而,相關的研究還沒有在西瓜中開展,因此,本研究對西瓜中的SUT基因家族進行了全面的鑒定和分析,為SUT基因西瓜中的進化、系統發育和功能提供了新的思路。本研究在西瓜中共鑒定到4個ClSUT基因,眾所周知,基因復制 (節段和串聯) 在進化過程中很常見,被認為是植物基因家族擴張的基本驅動力之一[29]。與茄科中SUT家族類似[26],本研究在西瓜中也未發現基因復制事件,這與已有研究結果一致,植物中SUT是一個小基因家族,不同物種通常包含3～9個成員[6-8,10],大部分物種中的SUT家族不存在基因擴張事件。

根據系統發育和結構分析發現,植物SUT被分為5個亞族：SUT1(雙子葉植物特異性)、SUT3和SUT5(單子葉植物特性)以及SUT2和SUT4(單子葉和雙子葉植物)[26]。本研究利用來自擬南芥、水稻和西瓜中的SUT進行進化分析,結果發現這些SUT也被分成5個亞族,西瓜ClSUT與擬南芥SUT的親緣關系更近,但是與報道[26]不同的是,在5個亞族中,亞族Ⅲ和Ⅳ是單子葉植物特異亞族,而亞族Ⅰ只含有來自雙子葉植物的SUT,這很可能說明,SUT家族是在單子葉和雙子葉植物分化后進行的家族擴張和變異。

在生長和發育過程中,植物受到各種環境條件的影響,如低溫和高溫、高鹽度和干旱等脅迫。先前的研究表明,SUT基因還參與控制植物對多種脅迫的反應[28,30-32],如在水稻暴露于干旱和鹽脅迫時OsSUT2基因的表達水平顯著上調[33]。在楊樹中,RNAi-PtaSUT4轉基因植物在急性短期干旱脅迫下表現出吸水率降低和萎蔫延遲[28]。煙草NtSUT1基因的過量表達可以減輕對根伸長的抑制,并賦予鋁脅迫處理下煙草細胞更高的生長能力[34-35]。野生型馬鈴薯植株中StSUT4的表達能夠被GA3和乙烯前體乙烯利顯著誘導[17]。此外,SA、GA和熱處理顯著誘導了油菜中的BnSUC1-2基因[30]。在本研究中,我們在西瓜ClSUT基因的啟動子中預測到多個脅迫(7個MeJA、3個生長素、3個赤霉素和3個脫落酸響應元件)和激素(4個厭氧脅迫、2個低溫和1個干旱響應元件)響應的順式作用元件。此外,基因表達譜也能為基因功能提供重要線索。我們用RNA-seq測序數據研究了西瓜ClSUT基因對野生(PI296341-FR)和栽培(97103)西瓜在授粉后不同時期的果實中的表達。在兩個西瓜材料中,ClSUT3和ClSUT4均幾乎在所有時期的果實中沒有檢測到表達,在野生型材料PI296341-FR中,ClSUT1和ClSUT2在大部分時期的果實中均有高表達,它們的表達均在授粉后26 d達到峰值,隨后顯著降低;而在栽培類型的材料97103中,ClSUT1的表達隨著過程成熟逐漸降低,而ClSUT2的表達則是逐漸升高,這說明ClSUT2很可能在果實成熟中蔗糖的轉運過程中發揮積極的作用。在對干旱和滲透脅迫的響應中,ClSUT3和ClSUT4在對照和處理后的葉片中幾乎都沒有被檢測到表達值,ClSUT1和ClSUT2很可能在脅迫反應中也發揮了更加重要的作用。滲透脅迫處理后,ClSUT1的表達水平顯著降低。而干旱處理,ClSUT2在干旱敏感(Y34)基因型中的表達顯著上調。總之,這些結果提供了關于西瓜ClSUT基因增強對各種脅迫耐受性的新線索。后續研究需要進一步分析、探討蔗糖轉運與不同脅迫引發的西瓜ClSUT基因的生理功能之間的可能關系。

綜上所述,本研究對西瓜中的ClSUT基因進行了全面的鑒定,并對他們的全基因組特征,包括它們的結構、進化關系、染色體位置、不同發育期的果實中的表達模式以及對不同非生物脅迫的反應的轉錄變化等進行了研究。進化分析發現,來自擬南芥、水稻和西瓜的ClSUT被分為5個亞族,其中西瓜ClSUT被聚類在亞族Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ。此外,本研究還對西瓜中ClSUT基因在不同發育時期的果實中的表達進行了分析,結果表明,ClSUT3和ClSUT4基本沒有表達,而ClSUT1和ClSUT2在果實中均有高表達,這兩個基因可能在西瓜果實發育中發揮更加重要的作用。對啟動子區的順式調控元件的分析,結合不同非生物脅迫的表達譜的分析表明,ClSUT1和ClSUT2很可能參與西瓜對各種非生物逆境和植物激素的反應。我們的研究結果為進一步研究西瓜SUT基因在脅迫反應中的作用奠定了基礎,有助于培育耐脅迫性更強的西瓜新品種,并加速西瓜遺傳育種。