基于大球蓋菇基因組的SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及指紋數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用

李雪松,孫達(dá)鋒,劉紹雄,張俊波,岳萬(wàn)松,李建英,華 蓉,*

(1.中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所,云南 昆明 650221; 2.云南省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院,云南 昆明, 650221)

大球蓋菇(StrophariarugosoannulataFarl. ex Murrill,S.rugosoannulata),別名皺環(huán)球蓋菇、酒紅色球蓋菇等,商品名為赤松茸,屬于擔(dān)子菌門(mén)(Basidomycota) 層菌綱(Hymenomycetes)傘菌目(Agaricales)球蓋菇科(Strophariaceae)球蓋菇屬(Stropharia)[1]。大球蓋菇原產(chǎn)于美國(guó),引進(jìn)國(guó)內(nèi)后在我國(guó)的西南地區(qū)得到廣泛種植[2]。大球蓋菇的栽培條件簡(jiǎn)單,模式多樣,原料廣泛,可生料栽培,發(fā)展前景廣闊[3]。大球蓋菇是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、口味鮮美、品質(zhì)優(yōu)良的食用菌。同時(shí),在抗疲勞[4]、抗氧化[5-7]、抗腫瘤[8]和免疫調(diào)節(jié)[9]、降血糖血脂[10]、抑菌[11]等方面具有一定的藥用價(jià)值。據(jù)中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì),2018年和2019年我國(guó)皺環(huán)球蓋菇產(chǎn)量比上一年分別增長(zhǎng)了96.92%和149.99%,2019 年產(chǎn)量超過(guò)了14萬(wàn)t[12]。

隨著大球蓋菇栽培面積逐漸擴(kuò)大,優(yōu)異栽培品種短缺、品種混亂、種性退化等菌種問(wèn)題尤為突出[13],阻礙了大球蓋菇產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。當(dāng)前大量學(xué)者在大球蓋菇的生物學(xué)特性、農(nóng)藝性狀、規(guī)范化栽培等方面開(kāi)展了一系列研究,在分子水平開(kāi)展大球蓋菇的遺傳多樣性、分子標(biāo)記、育種等方面的研究較少。分子標(biāo)記是一種遺傳標(biāo)記,是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的,可以直接反映出DNA水平的遺傳多態(tài)性[14],其中簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記就是應(yīng)用較為廣泛的標(biāo)記之一。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat, SSR)又被稱為短串聯(lián)重復(fù)序列(simple tandm reprat,STR)或微衛(wèi)星標(biāo)記(microsatellita),是由2～6個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)片段組成,分布于真核生物基因組中。SSR 分子標(biāo)記具有分布廣泛、位點(diǎn)特異、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)[15-17],因此,在食用菌的相關(guān)研究中被應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定、遺傳差異及多樣性、分子標(biāo)記輔助育種等方面[18-21]。其中,在羊肚菌、靈芝、黑木耳、金針菇、雙孢蘑菇、蛹蟲(chóng)草、暗褐網(wǎng)柄牛肝菌等食藥用菌的研究中均有報(bào)道[22-28]。近年來(lái),隨著越來(lái)越多的大型真菌基因組的完成及公布,使得基于基因組開(kāi)發(fā)物種特異的SSR引物成為可能。但目前尚未見(jiàn)基于基因組序列開(kāi)發(fā)大球蓋菇SSR標(biāo)記與應(yīng)用的相關(guān)研究報(bào)道。

本研究收集了13個(gè)大球蓋菇菌株,基于已公布的大球蓋菇基因組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)了SSR分子標(biāo)記,并利用開(kāi)發(fā)的SSR分子標(biāo)記對(duì)13個(gè)大球蓋菇菌株進(jìn)行鑒別,構(gòu)建了指紋編碼,明確13個(gè)大球蓋菇菌株間的遺傳差異;同時(shí),基于本研究開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記為大球蓋菇的種質(zhì)資源鑒定、品種選育、分子標(biāo)記輔助育種等研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

13份測(cè)試菌株收集自我國(guó)的多個(gè)地區(qū),其中DQG-1、DQG-2、DQG-4、DQG-5和ZJJQG001來(lái)自云南昆明,DQG-3和DQG-8來(lái)自云南曲靖,DQG-9來(lái)自云南普洱,DQG-6和DQG-7來(lái)自江蘇,DQG-10、DQG-11、DQG-12分別來(lái)自湖北、山東、四川。目前所有菌株保存于中華供銷合作總社昆明食用菌研究所菌種與資源研究中心。參考卯曉嵐[29]的《中國(guó)大型真菌》,13份測(cè)試菌株均為大球蓋菇菌。測(cè)試菌株中除了ZJJQG001子實(shí)體菌蓋顏色為金黃色,其余菌株子實(shí)體菌蓋顏色均為酒紅色。

此外,從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載球蓋菇屬(Stropharia)與香菇(Lentinulaedodes)的ITS序列,用于分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析,其中大球蓋菇的ITS登錄號(hào)為FJ810166.1、KC176328.1、MH860190.1,吉林球蓋菇(S.jilinensis)的ITS登錄號(hào)為JF961347.1,齒環(huán)球蓋菇(S.coronilla)的ITS登錄號(hào)為MH856747.1,淺赭色球蓋菇(S.hornemannii)的ITS登錄號(hào)為MT955153.1,木生球蓋菇(S.lignicola)的ITS登錄號(hào)為MW492530.1,銅綠球蓋菇(S.aeruginosa)的ITS登錄號(hào)為MW492534.1,哈迪球蓋菇(S.hardii)的ITS登錄號(hào)為MW821365.1,香菇的ITS登錄號(hào)為KT693242.1。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載大球蓋菇的基因組序列(GCA_003314255.1)[30]。

1.2 方法

1.2.1 菌絲體培養(yǎng)

取不同菌株的菌絲接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基(PDA)上,25 ℃避光靜置培養(yǎng)20 d,收集菌絲,-80 ℃保存。

1.2.2 基因組DNA提取

取保存的菌絲,使用DNA提取試劑盒(TSP101-200)提取DNA。DNA純度和濃度用0.8%瓊脂糖凝膠和NanoDrope 2000檢測(cè),-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ITS 擴(kuò)增與檢測(cè)

使用ITS 通用引物ITS4、ITS5進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL擴(kuò)增體系包括：金牌Mix(green,擎科 TSE101)20 μL、0.5 μmol·L-1上下游引物、50 ng 基因組模板DNA。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min;94 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR完成后,加6×上樣緩沖液5 μL ,混勻,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。檢測(cè)合格后,進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 序列比較與系統(tǒng)發(fā)育分析

以球蓋菇屬(Stropharia)物種的ITS序列作為參照,對(duì)13個(gè)菌株是否為大球蓋菇進(jìn)行分子鑒定。首先,使用Clustal W 1.8進(jìn)行多重比對(duì),對(duì)結(jié)果進(jìn)行人工修正。然后,使用MEGA 7軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析樹(shù)構(gòu)建,以Kimura 2-parameter模型計(jì)算遺傳距離,比對(duì)結(jié)果中空位或缺失堿基覆蓋率小于95%的位置進(jìn)行刪除。以香菇(Lentinulaedodes)作為復(fù)合外群,用NJ 法(neighbor-joining method)構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù),設(shè)置1 000次自展值進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.2.5 基于基因組序列設(shè)計(jì)和篩選大球蓋菇的特異性微衛(wèi)星引物

使用軟件Krait檢測(cè)并設(shè)計(jì) SSR 引物,篩選出適合擴(kuò)增的位點(diǎn)不重復(fù)的100對(duì)引物,進(jìn)行合成。SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL)：2×TSINGKE Master Mix(blue) 16.45 μL,10 μmol·L-1Primer F(加接頭)0.15 μL,10 μmol·L-1Primer R 1.2 μL,10 μmol·L-1Tag (熒光)1.2 μL,模板DNA 1 μL。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性10 s,60 ℃退火10 s,72 ℃延伸5 min,共35次循環(huán)。將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。根據(jù)鑒定結(jié)果來(lái)確定模板濃度,加水稀釋到合適濃度,進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

1.2.6 SSR引物的多樣性分析

獲取毛細(xì)管電泳的下機(jī)數(shù)據(jù)后,使用Gene mapper4.1軟件進(jìn)行分析,去除不合格數(shù)據(jù),最終建立原始數(shù)據(jù)矩陣。使用Popgen32軟件計(jì)算SSR位點(diǎn)的各項(xiàng)遺傳多樣性指標(biāo),包括觀測(cè)等位基因(Na)、有效等位基因(Ne)、香農(nóng)指數(shù)(I)、多態(tài)性信息指數(shù)(PIC)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)等。同時(shí),使用populations軟件構(gòu)建UPGMA樹(shù)進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析,自展值設(shè)置為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 大球蓋菇的ITS鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

將獲得的原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控,經(jīng)過(guò)質(zhì)控后的數(shù)據(jù)使用BLAST軟件將其與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明,13個(gè)菌株的ITS與數(shù)據(jù)庫(kù)大球蓋菇的相似度在99%以上。同時(shí),從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出球蓋菇屬的物種與香菇分開(kāi)為兩個(gè)大的進(jìn)化枝;在球蓋菇屬的進(jìn)化分枝中,13個(gè)菌株與大球蓋菇聚為一個(gè)小枝,且支持率為100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)的鑒定結(jié)果,可以認(rèn)定13個(gè)收集菌株均為球蓋菇屬的大球蓋菇(圖1)。

圖1 基于ITS的13個(gè)大球蓋菇菌株的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 NJ phylogenetic tree of 13 S. rugosoannulata strain based on ITS

2.2 大球蓋菇全基因組中SSR分布特點(diǎn)

共檢索到2 124個(gè)SSR,有6種SSR類型,其中主要以三核苷酸(P3)類型為主。單堿基至六堿基SSR分別為372、320、704、418、153和157個(gè),其中三堿基重復(fù)類型的SSR數(shù)目最多,共計(jì)704,占總數(shù)的33.15%。單堿基重復(fù)占總SSR的17.51%,主要以AT類型為主,有346個(gè),CG類型有26個(gè);其次,二堿基重復(fù)占總SSR的15.07%,主要類型有AC/GT、AG/CT、AT、GC、GA/TC、TA、CG和CA/TG,分別為156,31,39,3,27,33,4和27個(gè);四堿基的重復(fù)類型也較多,占總數(shù)的19.68%;五、六堿基重復(fù)類型較多,但總和只占全部SSR數(shù)量的14.59%(圖2)。

圖2 大球蓋菇基因組中SSR主要重復(fù)基元的分布Fig.2 Distribution of SSR repeat motifs of S. rugosoannulata

2.3 大球蓋菇SSR引物篩選與遺傳多樣性

根據(jù)大球蓋菇的基因組SSR的位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)與引物設(shè)計(jì)結(jié)果,從中選擇符合要求的100對(duì)SSR進(jìn)行合成和實(shí)驗(yàn)篩選。通過(guò)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)和毛細(xì)管電泳檢測(cè)100對(duì)SSR引物的多態(tài)性與穩(wěn)定性,最終篩選出16對(duì)多態(tài)性高、重復(fù)性好、特異性好的引物,分別為DQGSSR006、DQGSSR007、DQGSSR020、DQGSSR029、DQGSSR031、DQGSSR034、DQGSSR035、DQGSSR037、DQGSSR039、DQGSSR052、DQGSSR063、DQGSSR065、DQGSSR077、DQGSSR081、DQGSSR088和DQGSSR097。16對(duì)SSR引物的信息見(jiàn)表1。

篩選獲得的16對(duì)SSR引物的擴(kuò)增條帶最少為2條,最多為5條。毛細(xì)管電泳檢測(cè)獲得的片段條帶清晰、無(wú)雜峰,有助于后續(xù)的大球蓋菇的遺傳聚類和指紋編碼等分析。16對(duì)SSR引物。其中,DQGSSR020、DQGSSR031、DQGSSR077的多態(tài)性較高、特異性好、無(wú)雜峰、熒光亮度高、區(qū)分度好,擴(kuò)增出的片段與預(yù)期的基本一致(表2)。

表2 16對(duì)SSR引物的擴(kuò)增信息統(tǒng)計(jì)

16對(duì)SSR引物在13個(gè)大球蓋菇菌株中共檢測(cè)出42個(gè)等位基因位點(diǎn)(,頻率最高的等位基因?yàn)樵夹?(表3)。其中,最小等位基因數(shù)目為2,最大等位基因數(shù)目為5,平均每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)目為2.63。有效等位基因總數(shù)為34.72,數(shù)值變化范圍為1.17(DQGSSR006)～3.80(DQGSSR020),平均每個(gè)位點(diǎn)有效等位基因數(shù)目為2.17。其中,等位基因在群體中分布得越均勻,Ne越接近實(shí)際檢測(cè)到的等位基因數(shù)。香農(nóng)指數(shù)的數(shù)值范圍為0.27(DQGSSR006)～1.36(DQGGSSR020),平均值0.79。多態(tài)信息含量為0.13(DQGSSR006)～0.69(DQGSSR020),平均值0.41,其中14對(duì)引物具有較高的多態(tài)信息(PIC>0.25)。

將13個(gè)大球蓋菇菌株的16對(duì)SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增,使用populations軟件對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析,基于Nei的遺傳距離構(gòu)建13個(gè)大球蓋菇菌株的UPGMA聚類樹(shù)。圖3顯示出13個(gè)樣品大致分成了3個(gè)大的進(jìn)化枝,DQG-1、DQG-4、DQG-5、DQG-8、DQG-9、DQG-10、DQG-11、DQG-12為一個(gè)大的進(jìn)化枝,DQG-2、DQG-3、DQG-6、DQG-7又為一個(gè)大的進(jìn)化分枝,子實(shí)體為金黃色的ZJJQG001單獨(dú)為一個(gè)分枝。UPGMA樹(shù)的聚類結(jié)果與菌蓋顏色的表型呈現(xiàn)一致,即除ZJJQG001外,其余的大球蓋菇的菌蓋均體現(xiàn)為酒紅色。

2.4 大球蓋菇指紋編碼構(gòu)建

用DQGSSR006、DQGSSR007、DQGSSR020、DQGSSR029、DQGSSR031、DQGSSR034、DQGSSR035、DQGSSR037、DQGSSR039、DQGSSR052、DQGSSR063、DQGSSR065、DQGSSR077、DQGSSR081、DQGSSR088和DQGSSR097這16對(duì)引物進(jìn)行大球蓋菇DNA 指紋編碼數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建。DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)編碼的構(gòu)建方法參照陳世軍等[31]和陳昌文等[32]的賦值原則,根據(jù)16對(duì)引物擴(kuò)增出的片段大小的順序?qū)?3個(gè)大球蓋菇菌株進(jìn)行編碼(表4),編碼串聯(lián)后的數(shù)字組合即為該大球蓋菇菌株的DNA 指紋數(shù)據(jù)庫(kù)編碼。基于這16對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)每個(gè)大球蓋菇菌株的擴(kuò)增片段組合進(jìn)行編碼,獲得每個(gè)大球蓋菇菌株的36位數(shù)分子指紋數(shù)據(jù)庫(kù)編碼(表5)。

表4 擴(kuò)增片段與賦值

表5 大球蓋菇資源指紋數(shù)據(jù)庫(kù)編碼

3 討論

隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展,越來(lái)越多的菌種將流通于市場(chǎng),菌種真實(shí)性鑒定也將廣泛推廣[33]。目前,菌株的鑒定主要是通過(guò)對(duì)菌絲體的形態(tài)特征、拮抗試驗(yàn)、子實(shí)體的形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)等來(lái)完成,但以上鑒定方法存在易受環(huán)境因素、人為誤差等不確定因素的影響。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,一些分子標(biāo)記技術(shù)和方法已經(jīng)應(yīng)用于菌株鑒定的相關(guān)研究中,使得不同品種的鑒定變得便捷。

大球蓋菇是具有食藥用價(jià)值、栽培穩(wěn)定、產(chǎn)量高的食用菌之一,具有一定的發(fā)展前景及優(yōu)勢(shì)。而如何對(duì)不同的大球蓋菇菌株進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定區(qū)分,就是大球蓋菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展中急需解決的問(wèn)題。SSR分子標(biāo)記有分布廣泛、位點(diǎn)特異、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)[15-17],在多個(gè)食用菌品種的相關(guān)研究中均有報(bào)道,如：真姬菇[20]、金針菇[19,22]、香菇[21]、黑木耳[23]、靈芝[24]、雙孢蘑菇[26]等。在羊肚菌[25]、暗褐網(wǎng)柄牛肝菌[28]等食用菌中已有將SSR分子標(biāo)記應(yīng)用于品種鑒定的報(bào)道。

本研究中,基于已公布的大球蓋菇基因組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)了SSR分子標(biāo)記。首先開(kāi)展了大球蓋菇基因組SSR分布的分析,共檢索到2 124個(gè)SSR,總數(shù)多于云芝[18],與花臉香蘑[34]接近;重復(fù)類型主要以三核苷酸類型為主,占總數(shù)的33.15%;五、六堿基重復(fù)類型較多,但總和只占全部SSR數(shù)量的14.59%。而花臉香蘑[34]主要以單堿基類型為主,占總數(shù)的67.70%。這說(shuō)明不同大型真菌的SSR總數(shù)、重復(fù)類型、重復(fù)數(shù)目等都存在較大的差異。

通過(guò)設(shè)計(jì)100對(duì)引物進(jìn)行驗(yàn)證,篩選出16對(duì)多態(tài)性高、特異性好的SSR引物。最近,有學(xué)者在花臉香蘑SSR標(biāo)記[34]的開(kāi)發(fā)中就使用了花臉香蘑的基因組進(jìn)行SSR引物的設(shè)計(jì)及驗(yàn)證,結(jié)果表明,開(kāi)發(fā)出的SSR標(biāo)記可以較好地區(qū)分不同花臉香蘑菌株,可以精確地進(jìn)行菌株之間的區(qū)分。

篩選出的16對(duì)SSR引物的Shannon信息指數(shù)平均值為0.79,低于暗褐網(wǎng)柄牛肝菌[28],但高于工廠化主栽的雙孢蘑菇品種[35],說(shuō)明大球蓋菇SSR引物的多態(tài)性介于兩者之間。而期望雜合度和觀察雜合度高于青海黃色類群羊肚菌[25]。陳緒濤等[12]參考NYT1730—2009《食用菌菌種真實(shí)性鑒定 ISSR法》中28個(gè)ISSR引物開(kāi)展了大球蓋菇菌株遺傳多樣性分析,結(jié)果表明,使用的ISSR引物可以進(jìn)行不同類群的劃分,但無(wú)法對(duì)每一個(gè)菌株進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定,而且結(jié)果不易統(tǒng)計(jì),存在統(tǒng)計(jì)誤差。基于16對(duì)大球蓋菇SSR引物構(gòu)建的13個(gè)大球蓋菇菌株的UPGMA聚類樹(shù)顯示,13個(gè)大球蓋菇菌株大致分成了3個(gè)大的類群,金黃色的大球蓋菇(ZJJQG001)獨(dú)立為一類。其他的12個(gè)紅色大球蓋菇的聚類與地理來(lái)源不符,說(shuō)明栽培使用的大球蓋菇菌株較為混亂,12個(gè)紅色大球蓋菇菌株原始的來(lái)源可能是源于3個(gè)不同的菌株。

使用本研究開(kāi)發(fā)的16對(duì)SSR分子標(biāo)記對(duì)13個(gè)大球蓋菇菌株構(gòu)建指紋編碼庫(kù),獲得13個(gè)大球蓋菇菌株的32位數(shù)分子指紋編碼。16對(duì)大球蓋菇SSR引物組合雖然不能對(duì)實(shí)驗(yàn)使用的13個(gè)大球蓋菇菌株進(jìn)行精準(zhǔn)區(qū)分,但可區(qū)分大部分的大球蓋菇菌株,結(jié)果為后續(xù)大球蓋菇種質(zhì)資源鑒定、品種選育、分子標(biāo)記輔助育種等提供了基礎(chǔ)。