不同培養時間金針菇栽培基質的飼用營養價值評定

王 菲,韓宇杰,房 義,向 海,常 瀟,鐘榮珍,*

(1.中國科學院 東北地理與農業生態研究所 吉林省草地畜牧重點實驗室,吉林 長春 130102; 2.黑龍江省農業科學院 牡丹江分院,黑龍江 牡丹江 157041; 3.中國科學院大學 現代農業科學學院,北京 100049)

據統計,2019年我國秸稈資源總量為8.65億t[1],其中,有大量秸稈未得到資源化利用,被留在田間或被焚燒[2-3],不僅浪費資源,還會污染環境[4]。目前,農作物秸稈資源化利用的主要方向是用作肥料、飼料、基礎材料或原材料[5]。秸稈具有低氮、高木質素的特點,在飼料化應用上,其營養價值和消化率較低[5]。用物理法和化學法處理過的秸稈,在飼料化利用上雖然有一定的優點[6-7],但在營養和安全性方面存在一定缺陷。相較而言,生物法具有安全性高、環境影響小和能耗低等優點,極具發展潛力[7]。

我國是食用菌生產大國,2021年全國食用菌(鮮品)總產量達4 133.96萬t[8],工廠化產能穩居全球首位[9-10],其中,金針菇(Flammulinafiliformis)的產量高達215.57萬t[8]。金針菇栽培基質不僅含有原料中剩余的營養成分,還含有菌絲中的營養物質,具有免疫調節、抗菌和調節代謝等功能[11-16];因此,若能妥善利用栽培過程中的基質和采收后剩余的菌糠,不僅能降低廢棄物處理成本,還能緩解因處理不當而導致的環境污染。

木質素通過阻止瘤胃微生物接觸纖維素和半纖維素,使多糖不易被瘤胃微生物消化[17]。木腐菌具有復雜的胞外木質素分解酶系統,可以選擇性地去除木質素或改變其結構,使更多的纖維素暴露出來[18],從而更易被反芻動物消化[19]。研究表明,接種木質素降解菌Ceriporiopsissubvermispora和香菇(Lentinulaedodes)到小麥秸稈或橡木木屑中,基質中的木質素會被優先降解,但纖維素在干物質中的質量分數不受影響[5]。在肉牛飼養中,飼喂經金針菇菌絲分解后的秸稈,荷斯坦牛的腸道甲烷排放量顯著降低[20]。向飼料中添加金針菇菌糠,能夠提高肉牛的日增重,且不會對肉牛的健康造成負面影響[21]。用發酵菌糠替代白酒糟飼糧飼喂育肥牛,其瘤胃發酵參數、菌群多樣性、優勢菌門和菌屬的相對豐度均未受不良影響[22]。在肉羊飼養中,向粗飼料中添加30%的金針菇菌渣,對羔羊的生長性能、采食行為、反芻行為均有正向促進作用[23]。飼喂全株水稻與平菇菌糠共發酵的飼料,可以在不影響屠宰性能的前提下,提高瀏陽黑山羊肉的品質[24]。金針菇栽培基質中的剩余營養價值豐富,在反芻動物飼料應用上具有巨大潛力。本研究基于金針菇不同生長階段栽培基質中的營養變化和干物質消失率差異,期望找到適合的金針菇基質飼料化培養時間,為新型反芻動物飼料的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

金針菇供試菌株(白金F21-2)購自山東省壽光市食用菌研究所。

1.2 培養基質

PDA培養基：將200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、20 g瓊脂煮制過濾后定容至1 L,121 ℃高壓滅菌20 min。

PD培養基：將200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖煮制過濾后定容至1 L,121 ℃高壓滅菌20 min。

栽培基質：由30%(質量分數,下同)玉米秸稈、20%玉米芯、25%米糠、15%麥麩、8%棉籽殼、1% CaSO4、0.5% CaCO3和0.5%蔗糖混合而成,含水量60%,采用瓶栽方式,每瓶基質的鮮重約1 000 g,121 ℃高壓滅菌120 min。

1.3 栽培流程

用PDA培養基對菌種進行復壯和擴繁,待菌絲長滿后接入PD培養基中,25 ℃恒溫振蕩(180 r·min-1)培養12 d。接種前將菌種充分混勻,每瓶接種量15～20 mL,在25 ℃的菇房中黑暗培養22 d。菌絲長滿后,統一搔菌,搔菌深度為2 cm。搔菌后,將菌瓶移至10 ℃的菇房低溫刺激7 d。隨后,繼續降溫至5 ℃培養7 d進行催蕾。然后,將溫度調至8～12 ℃,濕度調節至85%～95%進行出菇。

1.4 采樣與測定

在栽培的0、9、14、18、22、29、36、51 d采樣,每次隨機取6瓶,以每瓶的基質作為一個重復。取樣后,將基質充分混勻,平均分成3份：1份鮮樣用于測定含水量;1份經冷凍干燥后用于粗蛋白(CP)含量和氨基酸(AA)組成測定;1份于65 ℃恒溫鼓風干燥至質量恒定后,用于其他指標的測定。

1.5 指標測定

采用干燥法(將樣品置于105 ℃的恒溫鼓風干燥箱中烘至質量恒定)測定含水量。采用凱氏定氮法測定CP含量。采用索氏提取法測定粗脂肪(EE)含量。參照GB/T 6438—2007《飼料中粗灰分的測定》,測定粗灰分含量;參照GB/T 20806—2022《飼料中中性洗滌纖維(NDF)的測定》,測定中性洗滌纖維(NDF)的含量;參照NY/T 1459—2007《飼料中酸性洗滌纖維的測定》,測定酸性洗滌纖維(ADF)的含量;參照GB/T 20805—2006《飼料中酸性洗滌木質素(ADL)的測定》,測定酸性洗滌木質素(ADL)的含量。參照《飼料分析及飼料質量檢測技術》[25]中的方法,測定纖維素和半纖維素含量。使用C7000雙干式快速量熱儀(德國IKA)測定總能量(GE)。參照文獻[26]中的方法,測定樣品的氨基酸組成及其含量。

將擴繁后的金針菇菌種接種到滅菌后的PD培養基中靜置培養3 d,然后將三角瓶置于搖床上25 ℃恒溫振蕩(180 r·min-1)培養 10 d。用4層潔凈紗布對菌液進行過濾,收集菌絲體,重復過濾3次后,用蒸餾水沖洗,收集菌絲體。將分離得到的菌絲體在-20 ℃條件進行預冷,然后使用Telstar LyoQuest真空冷凍干燥機(西班牙Telstar)進行冷凍干燥。參照文獻[27]的方法提取、測定麥角甾醇含量,借以估測菌絲含量。

采用尼龍袋法用6只做了瘤胃瘺管(通過手術安裝的連接瘤胃與體表的人工管道,采用橡膠材料制作,由帶基座的管體、外夾片、管塞組成)的綿羊進行體內消化試驗[28]。簡述如下：將(2.00±0.02 g)的樣品置于已稱重并記錄的尼龍袋底部,用尼龍線將袋口扎緊,在喂食前將裝有樣品的尼龍袋從羊瘤胃處的瘺管口處分別放入羊的瘤胃中進行體內消化,并將尼龍線固定在瘺管塞上,防止尼龍袋攪入食糜中難以取出。放置尼龍袋時需逐個分散放入,確保每個尼龍袋中的樣品都能與瘤胃液充分接觸,并方便后續取出。在對應尼龍袋放入瘤胃中進行體內消化2、4、8、12、24、48、72 h后從瘤胃中取出尼龍袋(將不放入瘤胃中進行體內消化的尼龍袋中的樣品記為0 h)。將從瘤胃中取出的尼龍袋放入清水中用手反復揉搓洗滌5 min,以去除附著在尼龍袋上的瘤胃液和食糜,重復洗滌3次,直至洗滌后的水保持清澈。最后,將所有樣品連同尼龍袋一同在恒溫鼓風干燥箱中65 ℃恒溫干燥48 h至質量恒定。將袋中殘留物轉移到已稱重并記錄的自封袋中,稱量殘留物的質量,計算干物質消失率。根據體內消化前和體內消化后樣品中的NDF、ADF、ADL、半纖維素、纖維素、CP含量,參照文獻[29]的方法,計算前述各營養物質的降解率。

1.6 數據分析

使用Excel 2016軟件進行數據統計和圖表繪制。使用SAS 9.4軟件中的一般線性模型進行數據分析。對于營養物質含量、氨基酸含量,及營養物質降解率,開展單因素方差分析;對干物質消失率,開展雙因素方差分析,分析栽培時間、體內消化時間,以及二者交互作用的影響。通過最小二乘法獲得平均值和標準差,對有顯著(P<0.05)差異的,采用Tukey法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 營養成分

基質含水量在栽培的前29 d逐漸增加(表1),并于29 d達到峰值(73.44%),隨后快速下降,至最終采收時(51 d),基質含水量下降至54.81%。隨著培養時間的延長,菌絲含量逐漸增加,并在36 d時達到峰值,之后隨著子實體長大、成熟并被采收,菌絲含量下降。CP含量的變化趨勢與基質含水量相似,均在29 d時達到峰值,之后隨著原基、子實體的形成,基質中的CP含量逐漸降低。粗脂肪含量在栽培的前14 d逐漸上升,隨后持續下降。在栽培初期,NDF和ADF含量下降,NDF在14 d開始回升,ADF在18 d開始回升,18 d之后NDF和ADF持續下降,ADF在36 d小幅度回升,隨后繼續下降;NDF在29 d后持續上升。ADL含量在栽培前期變化較小,自18 d起快速下降,在29 d達到最低值后持續回升。半纖維素和纖維素含量在栽培前期小幅度波動,29 d后,纖維素含量開始快速下降,半纖維素含量則開始上升。隨著栽培的進行,GE在14 d后開始下降,至29 d時達到最低值,雖然至36 d時有所回升,但隨后又隨著子實體的長成繼續下降。由于營養物質的持續消耗,粗灰分含量從始至終表現為持續上升趨勢。

表1 不同培養時間金針菇栽培基質的營養成分

2.2 氨基酸組成及其含量

隨著栽培時間的延長和子實體的生長,基質中的氨基酸向子實體轉移。總的來看,栽培基質中的必需氨基酸、非必需氨基酸和總氨基酸的含量在29 d時達到峰值,隨后持續下降(表2)。

表2 不同培養時間金針菇栽培基質及子實體的氨基酸組成

2.3 干物質消失率與營養物質降解率

雙因素方差分析結果顯示,栽培時間、體內消化時間,以及二者的交互作用均對干物質消失率有極顯著影響。對于同一時間點的栽培基質來說,隨著體內消化時間增長,干物質消失率增加(表3)。當體內消化時間為0～48 h時,在同一體內消化時間下,不同培養時間栽培基質的干物質消失率差異顯著;當體內消化時間為72 h時,不同培養時間栽培基質的干物質消失率無顯著差異。總的來看,隨著在瘤胃中進行體內消化時間的增長,不同培養時間栽培基質間的干物質消失率差異變小,與其他培養時間的栽培基質相比,培養51 d的栽培基質干物質消失率總體較高。

表3 不同培養時間金針菇栽培基質的干物質消失率

由于不同培養時間栽培基質在體內消化72 h時的干物質消失率無顯著差異,在后續測定消化后樣品的營養物質時,僅選擇體內消化24、48 h的樣品進行檢測(表4)。除ADF外,其他幾種營養物質的降解率在不同培養時間栽培基質上均有顯著差異。體內消化48 h后,NDF、ADL、半纖維素和CP的降解率較體內消化24 h時有較大幅度的提升,但纖維素降解率的變化相對較小。無論是體內消化24 h還是48 h,NDF和半纖維素的降解率均以培養36 d的栽培基質中最高。體內消化24 h時,ADL降解率以培養36 d的栽培基質中最高;體內消化48 h時,ADL降解率以培養51 d的栽培基質中最高。隨著培養時間延長,纖維素降解率總體呈下降趨勢。

表4 不同培養時間金針菇栽培基質的營養物質降解率

3 討論

3.1 營養物質的含量變化

金針菇作為木腐食用菌,可以產生多種胞外酶來分解木質纖維素,使得經過處理的秸稈更易被反芻動物的瘤胃消化。研究顯示,隨著金針菇培養時間延長,基質中的NDF和木質素含量會逐漸減少[30],栽培初期木質素含量短暫上升,可能是因為金針菇在栽培初期會先消耗更易分解的半纖維素[31],隨著底物中半纖維素含量的降低,NDF的占比開始增加。通常認為,NDF與ADF含量的差值即為半纖維素含量,ADF與ADL的差值即為纖維素含量,但是,NDF中還含有一些蛋白質,ADF中還包含一些果膠和未被洗滌完全的半纖維素,而ADL僅是酸性洗滌木質素,并不包含酸溶性木質素[31];因此,與纖維素和半纖維含量相比,木質素含量常常被低估。ADL雖然并不是全部的木質素,但它代表著細胞壁中最難消化的部分[32],其含量與動物的消化率成反比[32-33]。這就意味著,更低的ADL含量通常意味著更高的消化率。本研究結果證實,經過一定時間的栽培(菌絲生長過程)后,基質中的ADL含量顯著降低。

在栽培過程中準確測定基質中的菌絲含量是比較困難的,因此常需借助測定其他物質來間接測定,其中,使用麥角甾醇含量來估計基質中菌絲含量的方法較為常用。麥角甾醇是甾類化合物之一,是真菌細胞膜的重要組成成分[34],盡管麥角甾醇含量會受到生長時期的影響,但可以假設純菌絲體的麥角甾醇含量與栽培基質上生長的子實體相當。在栽培前期,菌絲逐漸在基質中生長,菌絲含量隨著栽培時間的延長而增多。36 d后,原基開始形成,在基質外繼續生長,逐漸形成子實體,51 d時子實體完成采收;因此,該階段基質中的菌絲含量下降。

栽培過程中,基質中的氮素和其他營養被利用轉化成子實體中的CP[18],碳源則轉化為菌絲體和二氧化碳。栽培的前29 d屬于菌絲生長階段,隨著栽培時間的延長,CP、總氨基酸含量隨著菌絲含量的增加而增加。栽培的第29 天是搔菌后低溫刺激的第7天,是菌絲生長較為旺盛的時期,此時的CP含量達到了峰值。栽培的29～36 d是菌絲從營養生長轉向生殖生長的關鍵時期,菌絲體轉化儲存更多的養分,用以保證后續子實體的質量。其間,菌絲體逐漸形成原基,菌絲體聚集在一起,菌絲密度進一步增加,CP含量顯著下降。栽培的36～51 d為出菇期,子實體逐漸生長,基質內的營養隨著子實體轉移到基質外,CP和EE含量持續顯著下降。

適宜的氨基酸組成能夠促進動物對飼料中蛋白質的吸收、利用,必需氨基酸缺乏會導致飼糧氨基酸不平衡[35],從而抑制羔羊的生長性能[36]。此外,必需氨基酸還與許多生理過程密切相關,如調控反芻動物胰島素mRNA翻譯的起始和延伸[37]。因此,日糧中的氨基酸組成是評價反芻動物飼料質量的重要指標[38]。在本試驗中,隨著栽培時間的延長,基質中的氨基酸總量和必需氨基酸含量先逐漸增加,于29 d時達到峰值,在隨后的出菇階段,基質中的營養逐漸轉移到子實體中,基質中的氨基酸含量下降。總體判斷,培養29 d的栽培基質飼用的營養成分相對最好。

3.2 營養成分的消化利用

目前,通過體內消化試驗來評價經食用菌處理的秸稈的營養價值和瘤胃降解率的研究還較少。一些體外消化試驗表明,經木腐菌處理的小麥秸稈可通過提高揮發性有機酸(VFA)產量、降低氨態氮濃度來增強瘤胃的發酵能力[6]。一般來說,干物質消失率在很大程度上受消化率和通過率的影響。打破木質素與細胞壁碳水化合物之間的連接,有助于提高NDF的消化率,增加可消化部分在瘤胃中的停留時間[39]。對比不同培養時間栽培基質的干物質消失率發現,干物質消失率最高的不是營養成分相對更好的29 d,而是完成采收的51 d。這可能是因為食用菌的生長會改變秸稈的表面形態,使其原本完整、致密、排列規律的表面變得松散,甚至裂成小碎片[40],從而更易被瘤胃吸收利用。而且,采收完成后剩余的菇腳會與基質共同作為菌渣處理,雖然菇腳的質量占比有限,但相較于單純的剩余基質,在營養成分和吸收利用難度方面也存在一定的差異。

對比各營養物質的降解率,在體內消化過程中,ADF降解率是最高的,各培養時間的栽培基質在體內消化24 h后ADF降解率均在98%以上,其次便是CP,在體內消化24 h的降解率均在77%以上,并且隨著消化時間延長,降解率持續上升。作為影響瘤胃消化秸稈的重要因素,更高的ADL降解率就意味著更多的ADL被分解轉化了。本試驗結果表明,相較于未經處理的基質(0 d),各培養時間栽培基質的ADL降解率都得到了不同限度的提高。