抗蜜蜂病毒天然產(chǎn)物的初步篩選研究

黃知楚,周倪紅,劉 瑤,鄭火青

(浙江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310058)

蜜蜂是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲,約三分之一的農(nóng)作物依賴于蜜蜂授粉,其授粉服務(wù)使農(nóng)作物增值約9.5%[1]。盡管世界糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(https：//www.fao.org/faostat/en/#data/QCL)表明,自2000年來(lái)全球蜂群總數(shù)增長(zhǎng)了45%,但其提供的蜂產(chǎn)品和授粉服務(wù)仍不能滿足日益增長(zhǎng)的世界人口數(shù)量和糧食產(chǎn)量需求[2]。而近十多年來(lái)大量的蜂群損失不僅加重了養(yǎng)蜂成本,也給如何滿足這些需求帶來(lái)了更大的挑戰(zhàn)。在影響蜜蜂健康的眾多因素中,蜜蜂病毒不僅廣泛分布,還因多呈隱性感染而在養(yǎng)蜂生產(chǎn)中被忽視[3-4]。以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus, IAPV)是蜂群中最常見的病毒之一,能夠侵染各生長(zhǎng)階段和各級(jí)型蜜蜂,患病蜜蜂失去飛行能力,伴隨翅震顫麻痹癥狀快速死亡,從而造成蜂群的大量損失[5-6]。

蜜蜂病毒病的防治是養(yǎng)蜂生產(chǎn)中的一個(gè)難題。由于在蜂群中使用農(nóng)用化合物會(huì)給蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn),研發(fā)綠色無(wú)污染的天然產(chǎn)物補(bǔ)充劑用于蜂群疾病防控有重要意義。多項(xiàng)研究表明,給蜜蜂補(bǔ)充天然產(chǎn)物補(bǔ)充劑能夠增強(qiáng)蜜蜂抗病毒能力,降低蜜蜂體內(nèi)病毒水平。如Palmer-Young等[7]研究表明,包括苦杏仁苷、桃葉珊瑚苷等在內(nèi)的7種天然產(chǎn)物都表現(xiàn)出對(duì)蜜蜂健康有益的方面,其中百里酚、梓醇和尼古丁顯著降低了蜜蜂殘翅病毒(deformed wing virus, DWV)的感染水平,上調(diào)了Imd和Toll通路調(diào)控的抗菌肽基因表達(dá)。Hsieh等[8]發(fā)現(xiàn),感染IAPV的蜜蜂攝入自然濃度的咖啡因可以顯著提高其存活率。Sun等[9]的結(jié)果表明,板藍(lán)根提取物可以抑制蜜蜂囊狀幼蟲病毒(sacbrood virus, SBV)復(fù)制,調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。

本研究在前人研究基礎(chǔ)上,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道選取了百里酚、青蒿素、梓醇、胡椒堿、可可堿、苦杏仁苷、咖啡酸、橙皮苷和ρ-香豆酸等9種可能對(duì)蜜蜂抗病毒有促進(jìn)作用的天然產(chǎn)物,并基于IAPV感染性強(qiáng)、發(fā)病癥狀顯著且分離純化方法成熟的優(yōu)點(diǎn),將其作為一種有價(jià)值的模型病毒感染蜜蜂,對(duì)預(yù)選天然產(chǎn)物進(jìn)行篩選和驗(yàn)證,同時(shí)分析有效天然產(chǎn)物對(duì)蜜蜂免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響,以期為養(yǎng)蜂生產(chǎn)上蜜蜂病毒病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所有供試的西方蜜蜂均取自浙江大學(xué)紫金港校區(qū)實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)。

9種天然產(chǎn)物化學(xué)品均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司(表1);超純總RNA快速提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購(gòu)自TaKaRa Bio公司。

表1 天然產(chǎn)物來(lái)源與試驗(yàn)濃度

試驗(yàn)儀器主要有全自動(dòng)樣品快速研磨儀(上海凈信科技有限公司)、高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5424R)、熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)、恒溫培養(yǎng)箱(寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)等。

1.2 以色列急性麻痹病毒(IAPV)液的制備與純化

參照Mullapudi等[17]的研究方法,首先制備以IAPV為主的病毒液,然后利用IAPV在工蜂蛹優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增的原理,將病毒液注射入白眼階段蜂蛹,恒溫恒濕培養(yǎng)箱(34～35 ℃,相對(duì)濕度75%～90%)中培養(yǎng)5 d后純化,獲得較純的IAPV病毒液。

1.3 天然產(chǎn)物抗病毒作用初步篩選

選取群勢(shì)6框(朗氏標(biāo)準(zhǔn)框)以上、無(wú)可見疾病癥狀、未檢出常見蜜蜂病毒感染的蜂群。取臨出房子脾置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱(34～35 ℃,相對(duì)濕度75%～90%),蜜蜂出房后統(tǒng)一收集于籠養(yǎng)試驗(yàn)盒中,每盒飼養(yǎng)50只蜜蜂。

蜜蜂收集完畢后先進(jìn)行2～4 h的饑餓處理,再飼喂含IAPV病毒的蔗糖溶液48 h。溶液配制方法如下：純化后的IAPV病毒液先在磷酸緩沖液(PBS)中梯度稀釋,最后一次稀釋至50%蔗糖溶液中,獲得IAPV濃度為0.8×108copies·μL-1的蔗糖溶液。飼喂期間每12 h更換一次新配制的蔗糖溶液以保證病毒效力。

處理48 h后所有蜜蜂進(jìn)行隨機(jī)分組,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。對(duì)照組設(shè)空白對(duì)照組(BC,僅飼喂蔗糖溶液)和陰性對(duì)照組(NC,飼喂含2%乙醇的蔗糖溶液)。試驗(yàn)的9種天然產(chǎn)物參考對(duì)應(yīng)文獻(xiàn)分別設(shè)置了高、低兩種濃度(表1),溶液配制時(shí)使用無(wú)水乙醇作為助溶劑。各處理組隨機(jī)飼喂含一種天然產(chǎn)物一種濃度的蔗糖溶液。在第7天時(shí)收集每個(gè)處理組樣本,測(cè)定蜜蜂體內(nèi)IAPV的病毒載量,初步篩選出具有抗蜜蜂病毒效果的天然產(chǎn)物。

1.4 有效天然產(chǎn)物抗病毒作用驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出可能有效的幾種天然產(chǎn)物的效果,我們另外選取自然攜帶有多種病毒的蜂群,收集蜂群條件下的成年工蜂,在實(shí)驗(yàn)室條件下研究這些天然產(chǎn)物對(duì)蜜蜂抵抗這些攜帶的蜜蜂病毒的作用。

選取群勢(shì)較弱的蜂群,檢測(cè)蜂群中常見蜜蜂病毒的感染情況,選取攜帶有IAPV、黑蜂王臺(tái)病毒(black queen cell virus, BQCV)、SBV這3種蜜蜂病毒的蜂群用于實(shí)驗(yàn)。將巢脾上的蜜蜂抖落到收集箱中,在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用CO2麻醉蜜蜂(30 s至1 min)并將其計(jì)數(shù)到籠養(yǎng)試驗(yàn)盒中。每盒飼養(yǎng)50只蜜蜂,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。隨機(jī)分組后給蜜蜂飼喂可能有效的天然產(chǎn)物,在第7天時(shí)收樣檢測(cè)蜜蜂體內(nèi)各流行病毒載量。

1.5 有效天然產(chǎn)物對(duì)蜜蜂免疫基因表達(dá)的影響

再次選取健康的新出房工蜂定量感染IAPV病毒,蜜蜂的收集和接種方法重復(fù)1.3節(jié)步驟,處理48 h后更換為含有效天然產(chǎn)物的蔗糖溶液。在第7天時(shí)收樣檢測(cè)蜜蜂體內(nèi)免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況。

1.6 病毒絕對(duì)定量與免疫基因相對(duì)定量

總RNA提取參照北京艾德萊生物科技有限公司超純總RNA快速提取試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照TaKaRa Bio公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行。對(duì)IAPV、BQCV、SBV等病毒進(jìn)行絕對(duì)定量。建立各病毒定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和每個(gè)樣本對(duì)應(yīng)的CT值計(jì)算目標(biāo)病毒的基因組拷貝數(shù)。反應(yīng)體系共10 μL,其中cDNA模板1 μL,上游和下游引物各0.5 μL(引物序列見表2),TB Green Premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus)5 μL以及RNase free water 3 μL,以H2O替代cDNA為空白對(duì)照。RT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃,1 min;40個(gè)循環(huán)反應(yīng)：95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min;熔解曲線：95 ℃ 15 s;60 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s。

表2 病毒絕對(duì)定量引物序列

各病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：YIAPV=-3.1444X+38.929,R2=0.985 9;YBQCV=-3.83X+47.487,R2=0.994 6;YSBV=-3.4718X+43.739,R2=0.998 6(Y代表CT值,X代表病毒的lg拷貝數(shù),病毒拷貝數(shù)為10Xcopies)。

對(duì)卵黃蛋白原基因vitellogenin(Vg),抗菌肽基因hymenoptaecin、abaecin、defensin,RANi通路關(guān)鍵基因dicer以及熱休克蛋白基因protein lethal (2)essential for life-like(pl2)、heat shock 70-ku protein cognate(hsc70)、heat shock protein 90 (hsp90)等8個(gè)免疫基因進(jìn)行相對(duì)定量。反應(yīng)體系與反應(yīng)程序參照病毒絕對(duì)定量(引物序列見表3),以β-actin作為內(nèi)參基因,采用2-△△CT法分析各基因相對(duì)定量結(jié)果。

表3 免疫基因相對(duì)定量引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 定量接種外源IAPV病毒液條件下天然產(chǎn)物抗病毒作用

定量接種外源IAPV病毒液后,飼喂糖水的空白組(BC)和飼喂糖水加乙醇的陰性對(duì)照組(NC)間病毒基因組拷貝數(shù)沒有顯著差異(tBC=6.233,tNC=6.160;P=0.547)。由圖1可知,9種物質(zhì)中,有4種物質(zhì)(百里酚、梓醇、胡椒堿、橙皮苷)在至少一個(gè)濃度下有一定的抗病毒作用趨勢(shì),其中,與對(duì)照組相比,10 μmol·L-1百里酚組IAPV病毒基因組拷貝數(shù)顯著更低(t=5.596,P=0.012),IAPV的病毒載量下降了46.89%。

*表示差異顯著(P<0.05)。下同。* indicates the significant difference (P<0.05).The same as below.圖1 九種天然產(chǎn)物對(duì)定量接種蜜蜂病毒IAPV的作用效果Fig.1 Effects of 9 natural products on exogenous honeybee virus IAPV

2.2 蜜蜂攜帶病毒條件下天然產(chǎn)物抗病毒作用

實(shí)驗(yàn)所用的蜂群主要攜帶BQCV、IAPV和SBV這3種蜜蜂病毒(圖2-A),在實(shí)驗(yàn)室條件下籠養(yǎng)7 d后,IAPV病毒載量極顯著升高(t0d=4.592,t7d=7.161,P<0.01)。

對(duì)百里酚、梓醇、胡椒堿和橙皮苷這4種物質(zhì)的抗病毒作用進(jìn)行進(jìn)一步研究。4種天然產(chǎn)物對(duì)蜂群中BQCV、IAPV和SBV這3種病毒作用效果如下圖所示,僅有10 μmol·L-1百里酚表現(xiàn)出對(duì)IAPV(t=6.403,P<0.05,圖3-A)和SBV(t=6.520,P<0.05,圖3-C)顯著降低的作用效果,IAPV和SBV的病毒載量分別下降了82.55%和86.31%。

A,對(duì)IAPV作用效果;B,對(duì)BQCV作用效果;C,對(duì)SBV作用效果。A, Effect on IAPV; B, Effect on BQCV; C, Effect on SBV.圖3 四種天然產(chǎn)物對(duì)蜜蜂多種病毒的作用效果Fig.3 Effect of 4 natural products on various viruses of honeybee

2.3 百里酚對(duì)蜜蜂免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖4可知,蜜蜂免疫相關(guān)基因Vg表達(dá)相較對(duì)照組顯著(P<0.01)提高了12.169倍,蜜蜂抗菌肽基因hymenoptaecin、defensin以及熱休克蛋白hsp90有升高趨勢(shì)(P>0.05)。

圖4 百里酚對(duì)蜜蜂免疫相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量影響Fig.4 Effects of thymol on the immune response of honeybees

3 討論

天然產(chǎn)物,也稱次級(jí)代謝產(chǎn)物,是指動(dòng)物、植物或微生物等天然來(lái)源的具有藥理學(xué)或生物學(xué)活性的化合物或其代謝產(chǎn)物[30]。天然產(chǎn)物獨(dú)特的理化結(jié)構(gòu)賦予其抗菌、抗病毒、抗氧化和抗炎等特性,因而在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品、能源等多領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用前景。

天然產(chǎn)物的抗病毒作用主要通過(guò)兩種途徑發(fā)揮作用,一是特異性抑制病毒的復(fù)制進(jìn)程,二是通過(guò)增強(qiáng)免疫系統(tǒng)使機(jī)體更有效地對(duì)抗病毒。養(yǎng)蜂生產(chǎn)中,蜂群往往同時(shí)感染多種病毒,因此在獲得特異性抗蜜蜂病毒藥物難度較大的情況下,通過(guò)綜合性的方法篩選能提高蜜蜂抗病毒能力的天然產(chǎn)物是比較可行的一個(gè)途徑。

本研究篩選的9種天然產(chǎn)物中,百里酚飼喂蜜蜂后表現(xiàn)出了明顯的促進(jìn)抗病毒作用。在外源接種IAPV的條件下,10 μmol·L-1百里酚飼喂7 d后,相對(duì)于對(duì)照組病毒載量下降了46.89%。蜜蜂抗病性相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果常因?qū)嶒?yàn)條件的改變而有不同。因此,我們?cè)诒狙芯恐?選用攜帶多種病毒的蜜蜂進(jìn)行進(jìn)一步的篩選驗(yàn)證,表明10 μmol·L-1百里酚使IAPV、SBV病毒載量分別下降了82.55%、86.31%,驗(yàn)證了其顯著的抗蜜蜂病毒作用。免疫基因表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果表明,10 μmol·L-1百里酚使蜜蜂免疫基因Vg的表達(dá)提高了12.169倍。Vg基因幾乎存在于所有卵生動(dòng)物中,昆蟲Vg通常在繁殖雌性的脂肪體細(xì)胞中表達(dá),作為卵黃蛋白的前體為胚胎發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[31]。然而,Vg在蜜蜂種群中進(jìn)化出了非產(chǎn)卵功能,該基因不僅由具有繁殖功能的蜂王表達(dá),也在雄蜂和不育工蜂中有表達(dá)[32-34],其功能包括但不限于參與免疫、營(yíng)養(yǎng)、抗應(yīng)激、行為發(fā)育、衰老、氧化應(yīng)激和長(zhǎng)壽等[35-37],因此,Vg是蜜蜂健康水平的重要指標(biāo)。這些結(jié)果表明,百里酚對(duì)蜜蜂健康有很大的促進(jìn)作用,并進(jìn)而提升蜜蜂的抗病毒能力。

百里酚,學(xué)名5-甲基-2-異丙基苯酚,是從唇形科、馬鞭草科、玄參科等植物精油中發(fā)現(xiàn)的主要單萜酚成分[38]。百里酚很早就被應(yīng)用于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué),并被證明具有抗炎、抗氧化等多種藥理活性[39],在蜜蜂抗病研究中也早有涉及。Wiese等[40]發(fā)現(xiàn),植物花蜜或花粉中的百里酚成分具有抑菌作用,蜜蜂會(huì)主動(dòng)采集這些物質(zhì)加強(qiáng)蜂群的社會(huì)防御。Glavinic等[11]證明了攝入百里酚有利于增加感染微孢子蟲的蜜蜂的存活率、免疫力和抗氧化保護(hù),但其并不適用于微孢子蟲的預(yù)防。Palmer-Young等[41]發(fā)現(xiàn),丁香酚與百里酚可以協(xié)同作用抑制熊蜂寄生蟲短膜蟲的生長(zhǎng)。這些研究結(jié)論結(jié)合本研究的結(jié)果說(shuō)明,百里酚在蜜蜂健康養(yǎng)殖中很有應(yīng)用前景,值得進(jìn)行深入開發(fā)。