高溫脅迫對小黃魚肝臟組織結(jié)構(gòu)和細胞凋亡的影響

何 雨,劉 峰,張?zhí)鞓?樓 寶,魏福亮,葉 挺

(1.湖州師范學院 生命科學學院,浙江 湖州 313002; 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 水生生物研究所,農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室,浙江 杭州 310021; 3.中國計量大學 生命科學學院,浙江 杭州 310018)

小黃魚(Larimichthyspolyactis)又名小鮮、黃花魚等,隸屬于鱸形目(Perciformes)石首魚科(Sciaenidae)黃魚屬(Larimichthys),廣泛分布于渤海、黃海、東海以及朝鮮半島西岸地區(qū),晝夜棲息于近底層,與大黃魚(Larimichthyscrocea)、帶魚(Trichiurusjaponicas)、曼氏無針烏賊(Sepiellamaindron)并稱為我國傳統(tǒng)“四大海產(chǎn)”[1]。繼大黃魚之后,小黃魚于2020年成功實現(xiàn)了規(guī)模化人工養(yǎng)殖[2],逐漸成為新興的重要海水養(yǎng)殖種類,具有極高的經(jīng)濟價值和發(fā)展前景。目前,對小黃魚的研究已從多方面展開,在人工繁育技術(shù)[3]、生物學特征[4]、形態(tài)性狀分析[5]、種質(zhì)資源挖掘[6]等方面均有部分研究報道。隨著小黃魚養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展,水體環(huán)境對小黃魚養(yǎng)殖的影響逐漸成為熱點問題。魚類為變溫動物,缺乏自身體溫調(diào)節(jié)機制,其體溫可隨水溫而變化[7]。所以,水溫是魚類生長發(fā)育過程中重要的環(huán)境因子,當水溫發(fā)生變化時,會直接影響魚體內(nèi)活性氧含量及抗氧化酶的活性,使機體的自由基代謝發(fā)生紊亂,繼而使魚體產(chǎn)生脅迫反應以響應環(huán)境的改變[8]。魚體對脅迫有一定的耐受性,當遭受輕度或短期性的脅迫時,隨著刺激的減弱,機體可以較快地恢復至正常,但過度或長時間的脅迫則會導致內(nèi)臟組織及機體喪失應對能力,內(nèi)部生理平衡狀態(tài)被打破,魚體表現(xiàn)出免疫機能降低及炎癥反應等病理狀態(tài),更甚者則會導致死亡[7]。研究顯示,高溫易導致魚體產(chǎn)生高溫應激反應[9]。小黃魚屬于廣溫性魚類,已有研究表明其高溫致死溫度為32 ℃[10],夏季高溫時期我國近海養(yǎng)殖區(qū)水溫偶有達到該溫度,對小黃魚的養(yǎng)殖存在巨大威脅。因此,探明高溫脅迫對小黃魚的影響作用,對于增強小黃魚在高溫條件下抗應激能力、提高高溫條件下養(yǎng)殖成活率實現(xiàn)健康養(yǎng)殖具有非常重要的實際意義。

高溫脅迫是影響魚類生理狀態(tài)的關(guān)鍵非生物因素之一[11],對魚類有諸多不利影響,如降低代謝活性[12]、導致魚體肝臟受損[13]、誘導細胞凋亡[14]等。魚類肝臟具有解毒、免疫防御和激素合成等作用,是與應激反應密切相關(guān)的重要代謝器官[15]。高溫脅迫導致肝臟損傷的研究在白梭吻鱸(Sanderlucioperca)[16]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[13]、團頭魴(Megalobramaamblycephala)[17]等許多魚類中均有報道。此外,多項研究顯示,高溫脅迫造成魚體細胞凋亡,如陸健等[18]研究發(fā)現(xiàn),高溫脅迫會使大口黑鱸(Micropterussalmoides)幼魚發(fā)生細胞凋亡甚至細胞壞死,郭曉麗等[19]和Jia等[20]研究分別指出高溫脅迫造成大菱鲆(Scophthalmusmaximus)心臟細胞和肝細胞凋亡。組織形態(tài)學變化是生化和生理損傷的綜合表現(xiàn),因此,它是應激反應的極佳生物標志[21]。通過觀察魚類肝臟的組織形態(tài)學變化情況,可以判斷出機體是否適應當前環(huán)境[22]。細胞凋亡是受細胞外微環(huán)境和細胞內(nèi)基因調(diào)控的一種細胞主動自殺性死亡方式。脅迫對細胞凋亡有調(diào)控作用,可通過多途徑激活細胞凋亡程序[23]。高溫對小黃魚的影響研究已有部分報道,主要包括高溫對肝臟氧化應激指標[10]、基因差異表達[24]的影響,而對于小黃魚肝臟組織形態(tài)以及細胞凋亡的影響還未見報道。

鑒于此,本次研究擬采用石蠟切片、顯微觀察及超微觀察技術(shù)研究高溫脅迫處理條件下小黃魚肝臟的顯微與超微結(jié)構(gòu)形態(tài)變化,通過TUNEL法檢測高溫脅迫條件下小黃魚肝臟組織的細胞凋亡情況,深入了解高溫脅迫對小黃魚肝臟組織的影響作用,從而進一步認識高溫對小黃魚的影響,為小黃魚的健康養(yǎng)殖管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從浙江省農(nóng)業(yè)科學院寧波象山基地海區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖的小黃魚中選取健壯個體共200尾,體長(16.90±1.37)cm、體重(45.20±12.42)g,置于2.5 m3的圓形養(yǎng)殖桶中暫養(yǎng)14 d。暫養(yǎng)期間水溫(15.0±0.3)℃,24 h不間斷增氧,保證溶氧5.5 mg·L-1以上。其間每天定時(7：00和17：00)投喂天邦膨化飼料(飼料粒徑3 mm),投喂后30 min左右虹吸法排水2/3,清理桶底殘渣糞便,并添加黑暗沉淀后過濾海水以保持養(yǎng)殖水體潔凈。

1.2 試驗方法

1.2.1 小黃魚高溫脅迫試驗

暫養(yǎng)結(jié)束后,選取體表無損傷、規(guī)格整齊的小黃魚放入6個0.5 m3容積的藍色塑料桶中,每桶25尾。實驗魚分為2組,每組3個平行。其中一組為急性高溫處理組,通過功率為1 000 W的加熱棒(圣盾)將水溫從(15.0±0.3)℃以2 ℃·h-1的恒定速率升高到(31.0±0.2)℃,并維持此溫度。對照組保持自然水溫養(yǎng)殖不做處理,實驗持續(xù)時間為96 h,實驗期間持續(xù)充氧,根據(jù)實驗魚攝食情況進行飽食投喂。

1.2.2 取樣

在實驗組水溫達到31℃的0、6、12、24、48、72、96 h,實驗組和對照組隨機各取9尾,每個平行3尾,丁香酚麻醉后解剖魚體,取肝臟組織。每份樣品剪取一部分保存于4%多聚甲醛溶液中,用于石蠟切片蘇木精-伊紅(HE)染色實驗,剩余樣品保存于電鏡固定液中,用于電鏡切片。

1.2.3 石蠟切片觀察

肝臟組織石蠟切片制備參照王云鋒[22]的實驗方法,概述如下：取經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24 h以上的小黃魚肝臟組織,將其放入乙醇中脫水,再放入二甲苯中透明,然后將其包埋于石蠟中,將石蠟切片成4 μm的厚度,再對其進行常規(guī)的脫蠟,并使用HE染色,然后使用中性樹膠封片,最后使用光學顯微鏡(徠卡DM4B)觀察并拍照。

1.2.4 透射電鏡觀察

肝臟組織電鏡切片制備參照周陽等[25]的實驗方法,概述如下：取經(jīng)電鏡固定液保存的小黃魚肝臟組織,切成約1mm3小塊后置于質(zhì)量分數(shù)為2.5%戊二醛溶液中,4 ℃下固定2 d,經(jīng)0.1 mol·L-1磷酸緩沖液PBS(pH值7.4)漂洗3次(每次15 min)后,置于質(zhì)量分數(shù)為1%鋨酸溶液避光室溫固定2 h,經(jīng)0.1 mol·L-1磷酸緩沖液PBS(pH值7.4)漂洗3次(每次15min)后,酒精梯度(30%-50%-70%-80%-95%-100%-100%)脫水(每次15 min),100%丙酮2次(每次20 min),用812包埋劑滲透并包埋,包埋板放于60 ℃烤箱聚合48 h后取出樹脂塊,利用徠卡Leica UC7型切片機進行超薄切片,經(jīng)2%醋酸鈾及2.6%枸櫞酸鉛染色后于日立HT7800/HT7700型透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 細胞凋亡檢測

TUNEL法檢測肝臟細胞凋亡,步驟如下：取經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24 h以上的小黃魚肝臟組織,依次放入乙醇中脫水、二甲苯中透明,然后將其包埋于石蠟中,將石蠟切片成4 μm的厚度,再對其進行常規(guī)的脫蠟,并使用中性樹膠封片,然后按照說明使用TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒(Servicebio G1501)進一步處理切片。最終獲得的切片置于光學顯微鏡(徠卡DM4B)下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對小黃魚肝臟顯微結(jié)構(gòu)的影響

HE染色結(jié)果顯示,對照組小黃魚的肝組織細胞形狀較規(guī)則,具有球形并帶有核仁的細胞核,而且細胞核基本都處在細胞的中間,各細胞結(jié)構(gòu)保持正常形態(tài),其中肝細胞之間分布少量的空泡(圖1-A)。經(jīng)31 ℃高溫處理0 h的實驗組肝臟組織未出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)變化,即還未呈現(xiàn)明顯的肝損傷(圖1-B);隨著高溫處理時間的延長,肝臟表現(xiàn)出不同程度、不同形式的損傷：高溫條件持續(xù)6 h后,肝臟出現(xiàn)了肝淤血病理學變化(圖1-C);12 h后,肝臟出現(xiàn)了細胞核移到肝細胞外圍、空泡變性和輕微水腫等病理學變化(圖1-D);24 h后,肝臟組織出現(xiàn)血竇擴張、空泡相對增多和細胞核位于肝細胞的一側(cè)等病理學變化(圖1-E);48 h后,肝臟組織出現(xiàn)空泡增多、肝淤血和水腫等病理學變化(圖1-F);72 h后,肝臟出現(xiàn)了嚴重的淤血、水腫以及細胞核移到肝細胞外圍等病理學變化,在細胞間和細胞質(zhì)中可見到大量的血球顆粒(圖1-G);在高溫持續(xù)96 h后,小黃魚肝臟出現(xiàn)了更為嚴重的病理學變化,包括肝臟出現(xiàn)水腫、細胞核消失甚至溶解和肝組織局部壞死,肝細胞原有結(jié)構(gòu)破壞等一系列肝損傷表征(圖1-H)。

A,對照;B,高溫處理0 h;C,高溫處理6 h;D,高溫處理12 h;E,高溫處理24 h;F,高溫處理48 h;G,高溫處理72 h;H,高溫處理96 h。CV,中央靜脈;HC,肝細胞;BC,血細胞;VD,空泡;AB,淤血;N,細胞核;Oe,水腫;H,結(jié)構(gòu)破壞。A, Control; B, 0 h high temperature stress; C, 6 h high temperature stress; D, 12 h high temperature stress; E, 24 h high temperature stress; F, 48 h high temperature stress; G, 72 h high temperature stress; H, 96 h high temperature stress. CV, Central veins; HC, Hepatocyte; BC, Blood corpuscle; VD, Vacuolation; AB, Gore; N, Nucleus; Oe, Oedema; H, Structural damage.圖1 高溫脅迫后小黃魚肝臟顯微結(jié)構(gòu)變化(H.E 染色,400×)Fig.1 Histology of Larimichthys polyactis liver after high temperature stress (H.E, 400×)

2.2 高溫脅迫對小黃魚肝臟超微結(jié)構(gòu)的影響

使用透射電子顯微鏡觀察高溫處理條件下各個取樣時間點的小黃魚肝組織超微結(jié)構(gòu)變化,結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出,對照組小黃魚的肝臟細胞核呈卵圓形,核內(nèi)核質(zhì)均勻,細胞中罕見溶酶體,偶見脂滴,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體清晰可見;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為主,層次整齊地排列在細胞核以及線粒體周圍;線粒體豐富,結(jié)構(gòu)清晰,雙膜完整,肝細胞具有發(fā)達的嵴和基質(zhì)(圖2-A)。高溫處理0 h實驗組的肝臟組織形態(tài)沒有出現(xiàn)明顯變化(圖2-B);高溫持續(xù)6 h后,肝臟組織細胞核總體呈圓形(圖2-C);12 h后,大小脂滴充斥肝細胞內(nèi)(圖2-D);24 h后,肝臟細胞核萎縮且核膜變形彎曲不光滑(圖2-E);48 h后,細胞內(nèi)初級溶酶體和次級溶酶體增多,多聚集在細胞膜附近,且細胞內(nèi)出現(xiàn)了大量脂褐質(zhì)(圖2-F);高溫持續(xù)處理72 h后,大小脂滴充斥肝細胞內(nèi),其中一些甚至比細胞核大,擠壓細胞核及其他細胞器,細胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量均減少(圖2-G);96 h后,細胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量均急劇減少,同時,線粒體數(shù)量減少,線粒體雙膜結(jié)構(gòu)被破壞,部分線粒體由于腫脹出現(xiàn)基質(zhì)斑塊化(圖2-H)。

A,對照;B,高溫處理0 h;C,高溫處理6 h;D,高溫處理12 h;E,高溫處理24 h;F,高溫處理48 h;G,高溫處理72 h;H, 高溫處理96 h。RER,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng);M,線粒體;F,脂滴;SER,滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng);L,脂褐質(zhì);PL,初級溶酶體;SL,次級溶酶體。A, Control; B, 0 h high temperature stress; C, 6 h high temperature stress; D, 12 h high temperature stress; E, 24 h high temperature stress; F, 48 h high temperature stress; G, 72 h high temperature stress; H, 96 h high temperature stress. RER, Rough endoplasmic reticulum; M, Mitochondrion; F, Lipid droplet; SER, Smooth endoplasmic reticulum; L,Lipofuscin; PL,Primary lysosome; SL, Secondary lysosome.圖2 高溫脅迫后小黃魚肝臟超微結(jié)構(gòu)變化(4 000×)Fig.2 Ultrastructure of Larimichthys polyactis liver under high temperature stress(4 000×)

2.3 高溫脅迫對小黃魚肝臟細胞凋亡的影響

脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法[terminal dexynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL]是研究生物體組織細胞凋亡情況的最廣泛使用的技術(shù)[26]。本研究通過TUNEL法檢測高溫脅迫下小黃魚肝臟細胞的凋亡情況,檢測結(jié)果如圖3所示。對照組小黃魚肝臟細胞核基本正常(圖3-A);與對照組相比,隨著高溫脅迫時間的持續(xù),高溫脅迫導致肝臟細胞凋亡現(xiàn)象逐漸加重(圖3-B-H),說明高溫脅迫時間的延長導致肝損傷程度逐漸加重,其中一個鮮明特征即為肝臟細胞凋亡率逐漸增加。

3 討論

3.1 小黃魚脅迫溫度的選擇

小黃魚屬于廣溫性魚類,研究表明,一定范圍的水溫升高,對小黃魚的生長發(fā)育具有促進作用[27]。但是報道指出,當水溫按照1 ℃·d-1的速率緩慢上升至32 ℃持續(xù)養(yǎng)殖2 d后開始出現(xiàn)個體死亡,一周內(nèi)累計死亡率達16.67%,同時存活個體的抗氧化酶活性明顯降低,表現(xiàn)出嚴重的應激損傷[10]。同時,急性高溫脅迫處理小黃魚的研究[24]表明,水體溫度按照2 ℃·h-1的速率快速上升至32 ℃時,維持此溫度24 h后,實驗魚全部死亡。為了進一步研究高溫脅迫對小黃魚肝臟組織的損傷作用,本次研究設(shè)定高溫脅迫處理水溫為31 ℃。

3.2 高溫脅迫對小黃魚肝臟組織及細胞結(jié)構(gòu)的影響

肝臟是魚體內(nèi)最大的消化器官,也是儲存糖原的主要部位。肝臟具有重要的生理功能,例如新陳代謝、排泄和解毒功能,其在生物體內(nèi)的狀態(tài)可以很好地反映出機體的生理和病理狀態(tài)[13]。已有研究表明,各種環(huán)境壓力都可能導致肝臟組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,甚至影響其功能。如飼料中的外源組胺可能導致黃顙魚(Tachysurusfulvidraco)肝臟出血和炎癥細胞浸潤[14];亞硝酸鹽暴露可能導致鳙(Hypophthalmichthysnobilis)的肝臟細胞核肥大和竇性擴張[15];持續(xù)高溫脅迫可能導致虹鱒肝臟脂肪變性、水泡變性、肝細胞壞死[16]。在本研究中,對照組小黃魚的肝組織細胞形狀較規(guī)則,具有球形并帶有核仁的細胞核,而且細胞核基本都處在細胞的中間,各細胞結(jié)構(gòu)保持正常形態(tài),但是,肝細胞之間分布少量的空泡,可能是肝糖原和脂肪被溶解所致,肝細胞內(nèi)的物質(zhì)合成速率與釋放速率的不平衡,導致組織學觀察空泡[22]。隨著高溫脅迫時間的延長,實驗組小黃魚肝細胞的肝糖原和脂肪被溶解加劇以提供大量消耗的能量,故表現(xiàn)為空泡增多[17]。本研究中,持續(xù)高溫脅迫后細胞核位于肝細胞的一側(cè),研究結(jié)果與草魚(Ctenopharyngodonidellus)肝組織病變癥狀[18]相似,這些現(xiàn)象顯示小黃魚肝臟的組織學變化隨著高溫脅迫的持續(xù),呈現(xiàn)出逐漸惡化的趨勢,說明長時間的高溫脅迫將會給小黃魚肝臟帶來嚴重損害,誘發(fā)肝臟疾病。

由于肝臟是排毒的主要器官,它極易受到損害,因此肝臟的變化可作為既往環(huán)境脅迫源暴露的標志物[28-29]。大量資料顯示,高溫脅迫導致魚體肝臟組織損傷[16,30-31],表現(xiàn)為較多肝細胞均出現(xiàn)空泡化、細胞間界限雜亂模糊、細胞核萎縮,嚴重的甚至出現(xiàn)溶解。祝璟琳等[32]研究還指出,高溫脅迫使病原菌感染對尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)肝臟損傷更為迅速,感染后期受損更嚴重。在本研究中,透射電鏡圖像顯示小黃魚肝臟細胞內(nèi)線粒體數(shù)量減少、線粒體雙膜結(jié)構(gòu)被破壞、部分線粒體由于腫脹出現(xiàn)基質(zhì)斑塊化,該現(xiàn)象與劉波[23]報道的高溫脅迫對團頭魴肝臟超微結(jié)構(gòu)的影響相一致。此外,隨著高溫脅迫時間的延長,小黃魚肝細胞細胞核萎縮,嚴重的甚至出現(xiàn)溶解,該現(xiàn)象與大口黑鱸報道結(jié)果相一致[29]。持續(xù)高溫脅迫后大小脂滴充斥小黃魚肝細胞內(nèi),其中一些甚至比細胞核大,擠壓細胞核及其他細胞器,這一結(jié)果在團頭魴的研究報道中已有類似報道[33]。所以,長時期的高溫脅迫將對小黃魚肝臟細胞內(nèi)細胞核、線粒體等各個細胞器均造成嚴重損害。

3.3 高溫脅迫對小黃魚肝臟細胞凋亡的影響

正常的細胞凋亡是生物體的一種生理機制,在維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起著非常重要的作用,但是嚴重的細胞凋亡會對魚類產(chǎn)生負面影響[34]。已有研究指出,多種脅迫源均能觸發(fā)魚體的細胞凋亡,如急性高溫脅迫可以誘導河豚(Takifuguobscurus)血細胞凋亡[35];持續(xù)高溫脅迫引起虹鱒肝臟細胞凋亡[36];高溫和低溫脅迫均會誘導青鳉(Oryziaslatipes)鰓組織發(fā)生凋亡[37];喹乙醇可引起鯉魚(Cyprinuscarpio)肝細胞凋亡[38];高濃度銅脅迫將誘導斑馬魚(Daniorerio)鰓細胞凋亡[24]。本研究基于TUNEL法檢測31℃高溫脅迫對小黃魚肝臟細胞凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)高溫脅迫會導致小黃魚肝臟細胞的凋亡,且隨著高溫脅迫時間的持續(xù)凋亡現(xiàn)象明顯加重,該現(xiàn)象與王云鋒[22]對白梭吻鱸的研究結(jié)果相一致。研究結(jié)果進一步證實了高溫脅迫將導致包括小黃魚在內(nèi)的多種魚類的肝臟細胞的非正常凋亡,出現(xiàn)嚴重的肝損傷。