水稻泛素連接酶D3與抗病相關蛋白VOZ2的互作分析

羅英杰,崔維軍,王忠華,吳月燕,林宏友,周 潔,嚴成其,3,*,王栩鳴,*

(1.浙江萬里學院 生物與環境學院,浙江 寧波 315100; 2.浙江省農業科學院 農產品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室,浙江 杭州310021; 3.寧波市農業科學研究院 生物技術研究所,浙江 寧波315100)

水稻是我國主要的糧食作物和口糧,其生產關系到我國的糧食安全。然而,水稻在生長發育過程中受到多種病蟲害的威脅。其中,由水稻黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo)引起的水稻白葉枯病,是水稻生產過程中一種常見且嚴重的病害[1],對水稻的生產安全造成嚴重的威脅。

據報道,施用噻唑鋅、噻森銅等農藥可有效防治白葉枯病[2-3],但農藥的不當使用容易造成環境污染,破壞生態平衡,不符合綠色、可持續的發展理念。同時,化學農藥的過度使用容易使病原菌產生抗藥性。培育和推廣抗病品種是防治水稻白葉枯病最為經濟、有效且環保的措施。因此,挖掘相關基因資源并解析其抗病機制對于水稻生產具有重要意義[4]。已有研究表明,獨腳金內酯(strigolactone, SL)及其通路中的重要組成部分多蘗矮稈基因dwarf-3(D3)在植物生長發育過程中起到重要作用[5-7]。SL是一類新發現的調控植物株型的重要激素[6,8-9],與植物抗病性有著非常密切的關聯[10],D3編碼的D3蛋白是一個與擬南芥Max2/ORE9同源的富含亮氨酸重復序列的F-box蛋白[11]。相關研究表明,D3蛋白能抑制水稻分蘗芽的活性,維持其休眠性[12]。D3組裝成的SCFD3復合體正調控SL信號[13],SL通過蛋白酶體-泛素途徑以一種依賴于D14/D14L-SCFD3復合體的方式誘導D53/OsSMAX1泛素化與降解[14],進而控制水稻地上分蘗枝[6]與中胚軸的伸長[15];D14L-SCFD3復合體作用于叢枝菌根(arbuscular mycorrhizal, AM)信號途徑上游,對水稻與AM共生關系的建立至關重要[7]。SCFD3復合體能降解糖原合成酶激酶2(glycogen synthase kinase 2, OsGSK2)磷酸化的細胞周期蛋白CYC U2并抑制中胚軸的伸長[16];D3蛋白可以延緩黑暗誘導的植物葉片衰老過程和過氧化氫誘導的植物葉片細胞死亡過程[17]。

據報道,擬南芥MAX2基因參與植物對果膠桿菌(Pectobacteriumcarotovorum)和丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的防衛反應[18],推測水稻中MAX2的同源基因D3可能在水稻的免疫防衛反應中發揮著重要的作用。前人研究發現,水稻d3突變體對白葉枯病的抗性明顯增強[19],然而其機制尚不明確。本研究中,我們通過酵母雙雜交(yeast two hybrid, Y2H)試驗篩選到了多個與D3存在互作的蛋白,其中包括維管植物單鋅指蛋白VOZ2。已有研究表明,VOZ2與白葉枯病菌Ⅲ型效應子XopN存在相互作用,共同調控水稻對部分白葉枯病菌小種的抗性[20]。在稻瘟病菌侵染過程中,VOZ1和VOZ2負調控水稻的基礎免疫防衛反應,但增強了稻瘟菌效應子觸發的免疫反應[21]。D3是SL激素信號傳導的重要基因,影響植物分蘗;而SL在植物防御反應中發揮積極作用。對D3基因功能的研究不僅能為抗病基因挖掘提供豐富資源,還可以為進一步闡述SL在水稻免疫防御反應機制提供分子基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗中所使用水稻為野生型日本晴(OryzasativaL. spp.japonicavar Nipponbare, Nip),煙草為野生型本氏煙草(Nicotianabenthamiana),均由實驗室提供。

KOD FX DNA聚合酶購自東洋紡生物科技有限公司;InFuion同源重組酶、酵母菌株Y2H Gold購自寶日醫生物技術有限公司;纖維素酶、果膠酶購自Yakult(養樂多投資有限公司);Flag抗體、Actin抗體、HRP標記二抗購自Abcam[艾博抗(上海)貿易有限公司];硝酸纖維素膜(NC膜)購自Merck(默克化工技術有限公司);cDNA模板、大腸埃希菌DH5α和農桿菌GV3101均為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 載體構建

從中國水稻數據庫(www.ricedata.cn)中獲得D3、VOZ2基因的CDS序列,然后用Primer Premier 5.0軟件設計引物,序列見表1。以逆轉錄所得的日本晴葉片cDNA為模板進行PCR擴增,PCR體系參照KOD FX DNA聚合酶說明書。

擴增獲得D3、VOZ2基因的CDS序列,通過InFusion同源重組將上述片段與經限制性核酸內切酶BciVⅠ線性化的pB2E-T載體連接。通過LR重組分別構建C端有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)、紅色熒光蛋白(red fluorescent protein, RFP)標簽的表達載體,以及nYFP(yellow fluorescent protein,YFP)、cYFP的表達載體,獲得D3-GFP、VOZ2-RFP、D3-nYFP、VOZ2-cYFP表達載體。

以pB2E-D3和pB2E-VOZ2質粒為模板,利用Primer Premier 5.0軟件設計引物。通過InFusion同源重組將D3與VOZ2基因的CDS片段分別與經限制性核酸內切酶NdeⅠ和BamHⅠ線性化的載體pGBKT7、pGADT7連接,獲得酵母表達載體pGBKT7-D3、pGADT7-VOZ2。通過同樣的方式將VOZ2基因的CDS片段與經限制性核酸內切酶BamHⅠ、SalⅠ線性化的載體pCAMBIA1300-35S-3×Flag連接,獲得帶Flag標簽的VOZ2-3×Flag表達載體。

1.2.2 酵母自激活與雙雜交驗證

通過聚乙二醇(PEG)/醋酸鋰轉化法將pGBKT7-D3質粒轉入酵母菌株Y2H Gold中,并涂布在SD/-Trp缺陷培養基上,30 ℃培養2～4 d,待長出單克隆后,挑取單克隆進行梯度稀釋,點板至預先涂布在含4 mg·mL-1X-α-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷)溶液的SD/-Trp缺陷培養基上;以共轉pGBKT7-Lam和pGADT7-T的Y2HGold酵母菌株作為陰性對照,以共轉pGBKT7-53和pGADT7-T的Y2H Gold酵母菌株作為陽性對照,在30 ℃培養箱倒置培養2～3 d,觀察酵母的生長情況。通過PEG/醋酸鋰轉化法,將pGBKT7-D3和pGADT7-VOZ2共轉酵母菌株Y2H Gold中,并涂布在SD/-Trp-Leu缺陷培養基上,30 ℃培養3～4 d;待長出單克隆后,挑取單克隆、陰性、陽性對照分別進行梯度稀釋,點板至SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His培養基,以及涂布在含4 mg·mL-1X-α-Gal溶液的SD/-Trp-Leu-His缺陷培養基上。30 ℃培養箱倒置培養3～5 d,觀察酵母的生長情況。

β-半乳糖苷酶活性測定。挑取上述單克隆至YPDA液體培養基中,30 ℃、230 r·min-1培養至吸光度D600至0.6左右,取出放置于冰上,加入Z buffer(100 mmol·L-1Na2HPO4,40 mmol·L-1NaH2PO4,10 mmol·L-1KCl,1 mmol·L-1MgSO4,1% β-巰基乙醇)、氯仿和質量分數0.1%的SDS進行裂解,酵母細胞進行充分裂解后加入4 mg·mL-1鄰硝基酚-β-半乳糖苷(ONPG)溶液,充分混勻后立即置于30 ℃水浴30～60 min,顯色。待顏色變黃后加入1 mol·L-1Na2CO3溶液終止反應,吸取上清測定各酵母菌株在420 nm和550 nm的吸光度。采用下式計算β-半乳糖苷酶活性：

E=1 000×[(D420-1.75×D550)]/(t×V×D600)。

(1)

式(1)中：E為β-半乳糖苷酶活性酶活性(單位為Miller units);D420和D550分別為顯色后的反應液在420 nm和550 nm的吸光度;D600為用于顯色分析的酵母細胞培養液在600 nm的吸光度;t為顯色反應時間(單位min);V為用于顯色分析的酵母細胞培養液體積(單位mL)。

1.2.3 水稻白葉枯病菌接種

將凍存的水稻白葉枯病菌P10小種接種至協本哲液體培養基中,在搖床(28 ℃,230 r·min-1)中活化培養過夜。隨后轉接至新的協本哲液體培養基中培養2～3 h,至D600為0.6～0.8,收集菌體。

采用剪葉法對14 d苗齡的Nip植株進行白葉枯病菌接種,以接種H2O的Nip植株為對照。分別于接種后0、2、6、8、12、24、36、48、60、72 h收集相同位置的水稻葉片組織,提取RNA并進行逆轉錄。通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測VOZ2基因在白葉枯病菌侵染不同時間點的表達水平。

1.2.4 水稻原生質體制備與轉化

取9311(Oryzasativassp.indicavar 9311)水稻種子,用體積分數75%的乙醇浸泡1 min,然后用體積分數30%次氯酸鈉溶液浸泡30 min,無菌水清洗3次后,播種至1/2 MS培養基上,于30 ℃培養箱中黑暗培養7～10 d。取出完成培養的水稻幼苗,用剪刀剪掉水稻根部保留部分莖桿;再用刀片將水稻葉鞘每段切成0.5 mm左右的薄片,隨后轉移至酶解液[含質量分數1.5%纖維素酶,質量分數0.75%果膠酶,質量分數0.1%牛血清白蛋白(BSA),0.6 mol·L-1甘露醇,10 mmol·L-1CaCl2,10 mmol·L-1MES(2-嗎啉乙磺酸),pH值5.7]中,25 ℃、60 r·min-1酶解4～5 h;用40 μm的尼龍過濾篩過濾碎渣,800×g離心3 min后收集沉淀,用W5溶液(154 mmol·L-1NaCl,125 mmol·L-1CaCl2,5 mmol·L-1KCl,2 mmol·L-1MES,pH值5.7)清洗原生質體,重復1～2次后加入MMG溶液(0.4 mol·L-1mannitol,15 mmol·L-1MgCl2,4 mmol·L-1MES,pH值5.7)重懸,靜置備用。

參考已報道的水稻原生質體解離[22]的方法,利用PEG轉化法將載體D3-GFP與VOZ2-RFP轉化至水稻原生質體中。

1.2.5 農桿菌介導的煙草葉片瞬時表達

將野生型本氏煙草種子播種于土缽中,置于25 ℃溫室培養至子葉完全伸展開,然后移栽到一次性小缽中培養約4周。將載體D3-nYFP、VOZ2-cYFP用電擊轉化的方式轉化至農桿菌GV3101中。挑取完成轉化的農桿菌轉移至LB液體培養基(含50 μg·mL-1卡那霉素和50 μg·mL-1利福平)中,在搖床(28 ℃,230 r·min-1)中培養至D600為0.8～1.0。5 000×g離心3 min收集菌體。用侵染液(含10 mmol·L-1MgCl2,10 mmol·L-1MES,150 μmol·L-1乙酰丁香酮,pH值5.6)調整兩者的菌液濃度至D600=0.6,然后混合均勻。使用無針頭注射器將菌液注射至合適的葉片背部,浸潤煙草葉片,48～72 h后在顯微鏡下觀察。

1.2.6 共定位與雙分子熒光互補(BiFC)實驗

將共轉D3-GFP和VOZ2-RFP的水稻原生質體培養16 h后,通過奧林巴斯共聚焦顯微鏡FV1000觀察水稻原生質體中的GFP和RFP熒光信號。觀察GFP熒光信號所使用的激發光和發射光波長分別為488 nm和520 nm,觀察RFP熒光信號所使用的激發光和發射光波長分別為561 nm和620 nm。

共浸潤轉D3-nYFP和VOZ2-cYFP載體的農桿菌48～72 h后,剪取部分浸潤區域的煙草葉片,于Lecia SPS激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察YFP熒光信號。激發光和發射光波長分別為512 nm和518～566 nm。

2 結果與分析

2.1 D3不存在自激活現象

由于某些蛋白可以在酵母中發揮轉錄激活作用,在無特異激活結構域的條件下便可使DNA結合結構域激活報告基因GAL4,產生“假陽性”結果[23]。因此,在進行酵母雙雜交實驗之前需要進行誘餌基因自激活檢測。MEL1是GAL4酵母雙雜交系統的一個報告基因,X-α-gal是酵母半乳糖苷酶(MEL1)的顯色底物,MEL1編碼的分泌型α-半乳糖酶可將X-α-gal水解為藍色產物[24]。結果顯示,轉化pGBKT7-D3后的酵母菌可以在SD/-Trp酵母培養基上正常生長,但無法使X-α-gal變藍(圖1),說明D3無自激活活性,可以進行后續酵母雙雜實驗。

圖1 D3自激活驗證Fig.1 Self-activation verification of D3

2.2 D3與VOZ2在酵母中存在互作

將共同轉化pGBKT7-D3和pGADT7-VOZ2的酵母菌,以及陽性對照、陰性對照酵母菌在2缺培養基(-Trp/Leu)上培養3 d后,共轉pGBKT7-D3與pGADT7-VOZ2的酵母和陽性對照pGBKT7-53+pGADT7-T均可在SD-Trp-Leu-His三缺培養基上正常生長,且可以使X-α-gal變藍。陰性對照組無法在SD-Trp-Leu-His三缺培養基上正常生長(圖2)。以上結果說明,D3與VOZ2能夠在酵母體內結合,并啟動部分下游報告基因的表達,證明D3與VOZ2在酵母體內發生了弱互作。

圖2 酵母雙雜交法驗證D3與VOZ2的蛋白互作Fig.2 The protein interaction between D3 and VOZ2 verified by yeast two-hybrid method

通過測定酵母的β-半乳糖苷酶活性來檢測D3與VOZ2在酵母體內的互作強度。結果(圖3)顯示,共轉pGBKT7-D3與pGADT7-VOZ2的酵母β-半乳糖苷酶活性弱于陽性對照,強于陰性對照,表明D3與VOZ2在酵母體內存在互作。

2.3 VOZ2基因受Xoo的誘導

在接種白葉枯病菌P10小種的0～6 h,Nip植株中VOZ2基因表達水平下調;6～72 h,VOZ2基因的表達水平總體上上調,且在12 h時表達水量最高(圖4),由此說明,VOZ2基因確實受到水稻白葉枯病菌的誘導,表明其可能參與水稻對白葉枯病菌的免疫反應過程。

2.4 D3與VOZ2在水稻原生質體細胞核中存在共同定位

為探究D3與VOZ2的亞細胞定位情況,利用水稻原生質體瞬時表達系統進行共定位實驗。將轉染12～16 h的水稻原生質體置于激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光分布情況。轉染D3-GFP的水稻原生質體在細胞核處有明顯綠色熒光,表明D3主要定位在細胞核中,與前人的結果一致[6]。

轉染VOZ2-RFP的水稻原生質體在細胞核和細胞質處均有明顯紅色熒光,表明VOZ2在水稻原生質體的細胞核與細胞質中均有分布。共同轉染D3-GFP、VOZ2-RFP的水稻原生質體在細胞核處出現綠色熒光與紅色熒光的疊加,表明D3與VOZ2在水稻細胞核中存在共定位(圖5)。

BF,明場;GFP,綠色熒光;RFP,紅色熒光;Merge,混合通道。BF, Bright field; GFP, Green fluorescent; RFP, Red fluorescent; Merge, Merge channel.圖5 D3與VOZ2的亞細胞定位Fig.5 Subcellular localization of D3 and VOZ2

2.5 D3與VOZ2在煙草葉肉細胞中存在互作

通過農桿菌介導的煙草瞬時表達系統進行BiFC實驗。激光共聚焦顯微鏡下觀察發現：共注射D3-nYFP、cYFP和nYFP、VOZ2-cYFP的煙草葉肉細胞在激光下無熒光信號(圖6),說明單獨的N端或者C端并不能引起黃色熒光的激發;共注射D3-nYFP、VOZ2-cYFP的煙草葉肉細胞在激光下細胞核與細胞質中均產生較強的熒光,表明D3與VOZ2在煙草葉肉細胞內發生互作,且發生互作的部位位于細胞核與細胞質中。

3 討論

推廣和種植抗病品種一方面可降低水稻生產過程中投入的人力、物力成本,提高水稻產量和質量;另一方面也有助于控制病害的發生與流行,是最為經濟有效的防治措施。目前,由稻黃單胞菌引起的白葉枯病是我國水稻生產過程中的主流病害之一。挖掘抗病基因并研究其抗病機理對培育抗病水稻品種具有重要意義。隨著水稻基因組測序工作的完成,許多抗病相關基因得以被發掘、研究、闡釋。目前的研究發現,許多SCF類復合物在植物免疫調控過程中發揮著重要的作用。Ao等[25]發現,擬南芥的SNIPER7過表達植株抗病反應增強且SCFSNIPER7復合體通過調控解折疊酶CDC48的蛋白水平,進而調控擬南芥的抗病反應。已有研究發現,SCF復合體亞基GF14e對水稻的白葉枯病和紋枯病抗性具有負調控作用[26]。D3作為SCFD3復合體的重要組成部分在抗病過程中的研究較少[13-14]。

D3基因編碼一個富含亮氨酸重復序列的F-box蛋白,其N端含F-box結構域,負責同SKPI蛋白互作,形成SCFD3復合體;其C端含LRRs結構域[27],能夠與靶蛋白特異性結合,并由SCFD3復合物通過泛素化途徑介導靶蛋白的降解[28]。目前在擬南芥中已鑒定到SMXL6、SMXL7、SMXL8為MAX2的靶蛋白[29],而在水稻中已知D3的靶蛋白只有D53。因此,進一步分析和鑒定D3的靶蛋白對于深入解析D3的調控網絡具有重要意義。

本研究通過酵母雙雜交試驗篩選到D3與VOZ2存在互作,VOZ2可作為D3潛在的靶蛋白。VOZ最早從擬南芥中克隆出來[30],過表達VOZ2可以增強擬南芥對炭疽病菌的抗性[31];另有研究發現,VOZ2可以通過與β-氨基丁酸的受體IBI1互作,參與調控擬南芥中胼胝質介導的防衛反應[32]。在水稻中,VOZ2同樣參與水稻對不同病原菌的免疫防衛反應,VOZ2與白葉枯病菌Ⅲ型效應子XopN存在相互作用[20];Wang等[21]研究發現,VOZ2降低了水稻對稻瘟病的基礎防衛反應,但增強了水稻Piz-t基因介導的抗病過程。

本研究證明,VOZ2基因受白葉枯病菌的誘導,D3與VOZ2存在相互作用,D3與VOZ2在水稻原生質體的細胞核中存在共定位。但目前的研究存在以下問題：首先D3與VOZ2蛋白互作強度較弱,推測D3促進VOZ2的降解,進而減弱了D3與VOZ2之間的互作強度;其次,在水稻原生質體與煙草葉肉細胞中,D3與VOZ2的互作位置存在差異,推測可能是由于水稻與煙草為不同物種,不同物種的細胞在翻譯表達基因時,其表達模式與影響因子不同,因而在互作位置上產生差異。下一步,我們將檢測D3對VOZ2穩定性的影響,構建并檢測voz2突變水稻材料和voz2/d3雙突變水稻材料,并通過大田實驗驗證各材料對白葉枯病的抗性。