白楊素通過調控SIRT1/AMPK信號通路對心肌缺血再灌注損傷老年大鼠的干預效果

劉永政 劉曉靜 王俊俠 劉平原 劉淑華

(秦皇島市第一醫院心內科,河北 秦皇島 066000)

缺血性心臟病是心血管疾病死亡的重要原因,治療手段目前主要是恢復缺血區心肌的血液供應,但血管再通后常出現心肌缺血再灌注損傷,而再灌注損傷會伴隨心肌細胞的凋亡和壞死〔1〕。研究發現〔2〕,心肌缺血再灌注損傷的發病機制涉及氧自由基生成過多、炎性反應等。沉默信息調節因子(SIRT)1/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路能通過感應集體能量及氧化應激狀態來在能量代謝中發揮出重要作用,調節其他轉錄因子的表達,也參與了調節細胞代謝穩態和氧化應激損傷的過程〔3〕。白楊素屬于黃酮類化合物的一種,具有抑制病態血管生成的作用〔4〕。研究報道〔5〕,其對心肌缺血再灌注損傷具有治療作用。但白楊素對心肌缺血再灌注損傷時對SIRT1/AMPK信號通路進行調控的研究國內還沒有相關報道,本研究探討白楊素調控SIRT1/AMPK信號通路對心肌缺血再灌注損傷老年大鼠的干預效果。

1 材料與方法

1.1實驗材料 研究動物:選取SPF級SD老年雄性大鼠30只,均為12～24月齡;體質量300～350 g,平均(337.12±10.46)g。SPF級SD老年雄性大鼠購自中國科學院自動化研究所,動物許可證號:SYXK(京)2020-0049。大鼠均按照實驗動物管理與保護中心的要求及規定來對老年大鼠進行嚴格的處置。整體環境:飼養環境22～25 ℃,平均(24.07±0.81)℃;相對濕度42%～67%,均由統一的實驗中心專業人員來進行管理和飼養,飼養過程中,每天均需要進行10～12 h光照,飼養過程中需滿足老年大鼠的日常飲水、飲食情況,從而對大鼠自身健康狀態進行維持,行適應性飼養1 w,飼養1 w后開始進行實驗。主要試劑、儀器:白楊素98%(上海純優生物科技有限公司,批號:180724)。白細胞介素(IL)-1β試劑盒(上海欽誠生物科技有限公司);前列地爾注射液(西安力邦制藥有限公司,國藥準字H20103101);肌酸激酶(CK,上海西唐生物科技有限公司);CK-同工酶(MB,上海梵態生物科技有限公司);肌鈣蛋白(cTn)I(上海白益生物科技有限公司);丙二醛(MDA,深圳海思安生物技術有限公司);超氧化物歧化酶(SOD,上海機純實業有限公司);活性氧(ROS,上海經科化學科技有限公司);核糖核酸(RNA)提取試劑盒(上海瓦蘭生物科技有限公司);cDNA逆轉錄試劑盒(江蘇天凈沙基因診斷技術有限公司);聚合酶鏈式反應(PCR)引物設計及合成(上海卓強生物科技有限公司);鼠抗兔SIRT1、AMPK(上海圻明生物科技有限公司);多功能酶標儀(上海實維實驗儀器技術有限公司;型號:SpectraMAX M2);離心機(廣州科適特科學儀器有限公司,型號:LSE TM);光學顯微鏡〔中輝徠博(北京)儀器有限公司,型號:DM3000-DM3000〕;RIPA裂解液(浙江羽翔生物科技有限公司);蛋白電泳儀(武漢時勝生物科技有限公司;型號:VP-1801)。

1.2分組與建模 將30只老年大鼠選取5只作為空白組,不做任何處理,進行正常喂養。其余25只老年大鼠參照羅斌等〔6〕研究心肌缺血再灌注損傷的造模方法來進行造模。首先,在實驗進行開始前,對老年大鼠進行12 h禁水、禁食,隨后對25只大鼠進行1% 5 ml/kg戊巴比妥鈉進行麻醉,待麻醉生效后將老年大鼠固定于解剖板,連接動物呼吸機來檢測老年大鼠的心電圖情況。將大鼠胸左側第三和第四肋骨之間進行開胸手術,對其包膜進行分離后將心臟進行充分暴露,剪開心包膜,在平左心耳下緣1.0～1.5 mm位置使用無損傷縫線進行進針,從左前降支后進行出針,進行結扎手術,通過肉眼觀察左心室情況,發現左心室存在顯著蒼白,與此同時心電圖監測結果ST段抬高達到缺血的目的。在進行結扎30 min后,恢復血供2 h內,其心肌缺血再灌注損傷模型造模成功。在造模過程中死亡7只,將其余18只老年大鼠分別分為模型組(6只)、藥物對照組(6只)、白楊素組(6只)。

1.3給藥干預 按參照文獻〔7〕給藥,白楊素組給予白楊素20 mg/kg灌胃(以白楊素量計算),1次/d,持續14 d;藥物對照組給予8 μg/kg前列地爾注射液進行治療,在進行最后1 d治療后將所有大鼠處死,收集大鼠心肌組織、血液樣本,來進行相關指標水平的檢測。空白組及模型組均灌注同等劑量的生理鹽水。

1.4心肌酶學指標、氧化及抗氧化水平 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測CK、CK-MB、cTnI、MDA、SOD、ROS水平。將采集的老年大鼠血液樣本通過離心機,以4 000 r/min、離心半徑9 cm,進行10 min離心處理,提取上清液。具體方法步驟:首先,將CK、CK-MB、cTnI、MDA、SOD、ROS標準品稀釋,倒入EP管,后加入CK、CK-MB、cTnI、MDA、SOD、ROS標準品,混勻,后將其倒入空白孔中,室溫下孵育55 min,在孔中加入洗滌緩沖液,重復清洗,后加入51 μl的CK、CK-MB、cTnI、MDA、SOD、ROS抗體,室溫下孵育1 h,加入洗滌緩沖液,重復清洗,加入102 μl SP結合液,封孔,室溫下孵育45 min,加入洗滌緩沖液,重復清洗,后加入87 μl四甲基聯苯胺(TMB)顯色液,570 nm下測定光密度(OD)值,測出CK、CK-MB、cTnI、MDA、SOD、ROS水平。

1.5SIRT1、AMPK mRNA表達 采用反轉錄(RT)-PCR法測定SIRT1、AMPK mRNA表達,采用SIRT1 mRNA試劑盒(廣州威佳科技有限公司)、AMPK mRNA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)提取血液內RNA,用RT-PCR試劑盒進行反轉錄反應,將cDNA,產物進行PCR擴增。條件參數為預火80 ℃預變性7 s,取出降溫至75℃,變性4 s,迅速降溫至55 ℃,退火13 s,溫度保持48 ℃,延伸43 s,26個循環,重復實驗3次。內參GAPDH上游引物:5′-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3′,下游:5′-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3′;SIRT1上游引物:5′-GCTCGCCTTGCTGTGGACTTC-3′,下游:5′-GTGACACAGAGATGGCTGGAACTG-3′;AMPK上游引物:5′-TTGCGTGTGCGAAGGAAGAACC-3′,下游:5′-CCG ATCTCTGTGGAGTAGCAGTCC-3′。以GAPDH為內參,采用2-ΔΔCt方法計算SIRT1、AMPK mRNA表達量。

1.6SIRT1、AMPK蛋白表達 采用Western印跡檢測老年大鼠骨組織中SIRT1、AMPK蛋白表達量。取出低溫保存的心肌組織,進行生理鹽水沖洗,沖洗干凈后進行組織切片(切片厚度為2 μm),完成切片后,采用裂解液溶解心肌組織切片,進行組織勻漿制作。使用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒對SIRT1、AMPK蛋白量進行檢測,提取等量蛋白質,隨后置于高溫1 600 ℃中進行5 min變性處理。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)于每孔加入52 μg蛋白后進行,電泳結束后將蛋白電轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉對PVDF膜進行封閉,常溫下對SIRT1、AMPK二抗(1∶1 000)置于搖床上進行孵育,共進行2 h孵育,完成后采用TBST洗膜3次,5 min/次,以GAPDH為內參,計算SIRT1、AMPK蛋白表達量。

1.7統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、F檢驗。

2 結 果

2.1各組心肌酶學指標水平比較 如表1所示,白楊素組CK、CK-MB、cTnI水平高于空白組,低于模型組、藥物對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組心肌酶學指標水平、氧化及抗氧化水平比較

2.2各組氧化及抗氧化水平比較 如表1所示,白楊素組MDA、ROS水平高于空白組,低于模型組、藥物對照組,SOD水平低于空白組,高于模型組、藥物對照組,差異有統計學意義(均P<0.05)。

2.3各組SIRT1、AMPK mRNA及蛋白表達對比 如表2所示,白楊素組SIRT1、AMPK mRNA及蛋白表達低于空白組,高于模型組、藥物對照組,差異均有統計學意義(均P<0.05)。

表2 各組SIRT1、AMPK mRNA及蛋白表達對比

3 討 論

CK、CK-MB、cTnI是臨床中對心肌損傷程度情況進行判斷的心肌酶譜相關指標〔8,9〕。正常生理條件下,心肌酶譜相關指標水平普遍呈低表達狀態,而在發生缺血再灌注損傷時,心肌細胞受損會出現變性破裂和壞死,致使CK、CK-MB、cTnI水平異常升高〔10～12〕。氧化應激也是造成心肌缺血再灌注損傷發展的關鍵,主要為組織內大量ROS生成,SOD濃度異常降低,導致其線粒體有氧代謝能力出現損傷,破壞自身功能穩態情況,使心肌細胞出現異常凋亡〔13～15〕。本研究結果提示,白楊素能夠改善心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌損傷情況,抑制老年大鼠體內氧化應激反應情況,減輕心肌缺血再灌注損傷后氧自由基對心肌細胞膜脂質過氧化的損傷情況,提升心肌抗氧化能力。

線粒體是心肌缺血再灌注損傷時ROS的主要合成處,同時也是心肌細胞能量加工場所,缺氧使抗氧化酶活性降低,ROS堆積〔16〕。現有研究發現,SIRT1是一種Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶,調節糖脂代謝,抑制炎癥和氧化應激損傷,與許多心血管病如動脈粥樣硬化、心肌缺血等的發生密切相關〔17〕。多種藥物通過作用于SIRT1來調節線粒體的功能,如白藜蘆醇可以提高SIRT1及線粒體蛋白的表達,降低ROS,保證心肌細胞線粒體穩定〔18〕。當心肌缺血時,信號通路激活被認為是一種內源性代償機制來保護心肌免受氧化應激和損傷,通過抑制炎癥反應自噬、氧化應激來減輕心肌缺血,且這些機制之間相互聯系和相互作用。SIRT1可通過調節核因子(NF)-κB、AMPK等信號通路,發揮舒張血管、保護心肌等作用〔19〕。AMPK是能量調節的關鍵分子,心肌缺血時可被激活來調節細胞內的生物功能,心肌細胞中SIRT1能激活AMPK的上游肝臟激酶(LK)B1使AMPK上升〔20〕。SIRT1/AMPK信號通路能通過特異的方式調節細胞的代謝及凋亡,或可以成為治療心肌缺血性心臟疾病的潛在靶點〔21,22〕。相關研究證實,心肌缺血再灌注后大鼠心肌組織明顯受損,細胞處于缺血缺氧的應激狀態,氧供缺乏,導致體內ATP生成不足、AMP含量增加,使AMPK被磷酸化激活〔17〕。活化的AMPK可作用于多種下游底物,抑制ATP消耗,并啟動生成ATP的途徑,以維持機體能量代謝平衡,增加細胞內依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的含量,繼而使SIRT1被激活而發揮其相應生物學效應〔23,24〕。本研究結果表明,白楊素可通過改善缺血心肌細胞ATP的能量代謝,從而保護受損心肌。在心肌缺血缺氧時,AMPK作為細胞能量感應器,可被迅速磷酸化從而發揮其調節作用。

綜上,白楊素在心肌缺血再灌注損傷過程中能對SIRT1/AMPK信號通路進行激活,改善心肌損傷,抑制氧化應激,調節能量代謝,從而發揮其對心肌組織的保護作用。