紅外頻譜照射對大鼠急性痛風性關節炎損傷的改善作用

熊愛華 齊春麗 王欣 呂俊華

(暨南大學 1藥學院,廣東 廣州 510632;2醫學實驗動物中心;3廣東駿豐頻譜股份有限公司)

高尿酸血癥與痛風發生關系密切,有5%～12%的高尿酸血癥患者可發展為痛風〔1〕。痛風性關節炎急性發作是由于高尿酸中的尿酸鈉(MSU)在關節及關節周圍組織以結晶形式沉積引起的急性炎癥反應〔2,3〕。痛風性關節炎的患病率呈現出逐年遞增的趨勢,歐洲風濕病聯盟(EULAR)發布的數據顯示,西方65歲以上老年人癥狀性痛風的患病率達7%〔4〕。目前痛風性關節炎主要依賴于藥物治療,但周期長、安全性差,且副作用大〔5〕。因此尋找有效、安全、適于長期治療的方法就顯得尤為重要。紅外線又稱紅外輻射,屬于波長在0.75～1 000.00 μm范圍的電磁波,其具有顯著的熱效應,可以改善局部血液循環,促進腫脹消退,兼具消炎和鎮痛作用〔6,7〕。此外,紅外頻譜在關節型銀屑病、產后康復、玫瑰糠疹、部分慢性病、腰椎間盤突出等疾病領域具有廣泛應用〔8～12〕。本研究探討紅外頻譜照射對大鼠急性痛風性關節炎損傷的改善作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及環境 SPF級SD雄性大鼠42只,平均體質量(200±20)g,購于廣東省醫學實驗動物中心,許可證號:SCXK(粵)2013-0020。動物飼養實驗室恒溫22 ℃、相對濕度65%～75%、光照周期12 h。

1.2試劑及儀器 氧嗪酸鉀(純度99%,批號:170606-02,山東中科泰斗化學有限公司);羧甲基纖維素鈉(純度99.5%,批號:254753,上海賽璐珞廠);腫瘤壞死因子(TNF)-α(批號:201710)、白細胞介素(IL)-17a(批號:201710)試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司);尿酸檢測試劑盒(批號:20171008,南京建成生物工程研究所);5424R小型高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司);MULTIFUGE X1R大型冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司);GH3000隔水培養箱(天津市泰斯特儀器有限公司);Synergy HT多功能酶標儀(美國BioTek公司);MF41制冰機(意大利Scotsman公司);熒光顯微鏡(日本奧林巴斯),石蠟包埋機(中國湖北歐美萊醫療科技有限責任公司),手動旋轉式石蠟切片機(德國Slfe);足趾儀(PV200,成都泰盟科技有限公司);駿豐頻譜治療保健儀(廣東駿豐頻譜股份有限公司,紅外頻譜波長范圍為3～25 μm)。

1.3實驗方法 大鼠適應性喂養5～7 d后,稱體質量,通過隨機數字表法,隨機分為正常對照組(14只)和造模組(28只)。造模組每天灌胃氧嗪酸鉀(準確稱取適量的氧嗪酸鉀溶于0.5%羧甲基纖維素鈉,配制2 g/kg的氧嗪酸鉀懸浮液),灌胃容積10 ml/kg;正常對照組給予等體積的溶媒(0.5%羧甲基纖維素鈉)。連續7 d后,腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)進行麻醉,眼眶后靜脈叢取血0.5 ml,靜置2～3 h,4 ℃、7 000 r/min離心15 min取血清測定尿酸含量。將尿酸含量高于110 μmol/L的大鼠確定為造模成功。

將造模成功的大鼠隨機分為模型對照組(14只)、紅外頻譜照射組(14只)。除正常對照組給予等體積的溶媒(0.5%羧甲基纖維素鈉)外,各組大鼠繼續每天灌胃氧嗪酸鉀(2 g/kg),灌胃給藥容積10 ml/kg。同時,紅外頻譜照射組每天給予紅外頻譜照射(2檔)40 min,正常對照組和模型對照組不需照射。分別于紅外頻譜照射處理30、45 d測定尿酸含量。此外,45 d時,各組大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后仰臥固定,將2.5% MSU 0.2 ml直接注射于模型對照組和紅外頻譜照射組踝關節腔中。注射時將大鼠右(左)踝關節彎曲,捫及兩骨突起,局部消毒后,用注射器自兩骨突之間進針,感覺有空洞感后,注入MSU溶液0.2 ml,以關節囊對側鼓起為注入標準,在高尿酸的情況下,制備急性痛風性關節炎模型。正常對照組右(左)踝關節注射等體積的生理鹽水。分別于注射后0、1、4、24 h及3、7 d分別測量關節的腫脹程度,計算腫脹率和抑制率:腫脹率(%)=(致炎后足跖容積-致炎前足跖容積)/致炎前足跖容積×100%。

注射MSU后繼續給予氧嗪酸鉀和紅外頻譜照射,于紅外頻譜照射處理至60 d時,末次處理50 min后,3%戊巴比妥鈉麻醉后,腹主動脈取血,靜置2～3 h,以離心力7 000 r/min離心15 min后取上清,血清分裝,-20 ℃保存,用于免疫指標測定。切取各組右踝關節,在冰盤上操作,除去關節周圍的皮膚、肌肉、筋膜等,浸泡于10%甲醛溶液中。

1.4血清指標檢測 采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定血清尿酸;使用酶聯免疫吸附試驗試劑盒測定血清IL-17a和TNF-α水平;具體操作均按照試劑盒說明書進行。

1.5踝關節病理學檢查 大鼠踝關節浸泡于10%甲醛溶液中2～3 d后,再浸泡在乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液中脫鈣處理。脫鈣液需浸沒踝關節2 cm左右,每天更換脫鈣液,直至完全脫鈣;常規固定、脫水、包埋、切片、制片,蘇木素-伊紅(HE)染色后,光學顯微鏡下觀察踝關節病理學組織改變。

1.6統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1紅外頻譜照射對模型大鼠血清尿酸水平的影響 與正常對照組相比,模型對照組處理前及處理后30、45、60 d,其血清尿酸水平顯著升高(P<0.01);與模型對照組相比,紅外頻譜照射組各時間點血清尿酸水平略有降低,但差異不顯著(P>0.05)。見表1。

表1 各組血清尿酸水平及血清IL-17a、TNF-α水平比較

2.2紅外頻譜照射對模型大鼠血清炎性細胞因子的影響 與正常對照組相比,模型對照組血清IL-17a和TNF-α水平均顯著升高(P<0.05,P<0.01);與模型對照組相比,紅外頻譜照射組血清IL-17a水平顯著降低(P<0.05),而TNF-α水平略有降低,但差異不顯著(P>0.05)。見表1。

2.3紅外頻譜照射對模型大鼠關節腫脹程度的影響 與正常對照組相比,模型對照組關節注射尿酸鈉后1、4、24、36 h及3、7 d內,其關節腫脹程度顯著升高(P<0.01);與模型對照組相比,紅外頻譜照射組關節腫脹度在1、4、24、36 h內無顯著變化,而在3、7 d均顯著減輕(P<0.05,P<0.01)。見表2。

表2 各組不同時間關節腫脹率比較

2.4紅外頻譜照射對模型大鼠關節病理損傷的影響 正常對照組關節軟骨細胞形態正常,排列整齊,滑膜組織表面光滑,無充血水腫及炎性細胞浸潤。模型對照組關節滑膜組織表面粗糙、充血水腫,滑膜表層細胞和滑膜下組織明顯增生,有散在或局灶性炎性細胞浸潤,軟骨表面粗糙不平,有散在或局灶性的淋巴細胞和單核細胞聚集在關節表面,有軟骨細胞變性、排列紊亂。紅外頻譜照射組關節病理變化減輕,關節滑膜表層細胞輕度或中度增生,有輕度炎性細胞聚集,軟骨細胞排列整齊,細胞形態基本正常。見圖1。

圖1 各組關節病理(HE染色,×200)

3 討 論

高尿酸血癥是痛風的主要原因,由于尿酸增高形成尿石沉積于腎臟和關節處,導致腎臟和關節出現典型的炎性損傷〔13,14〕。本研究結果表明,在高尿酸的情況下,局部炎性關節損傷形成時,也伴隨著血清炎性細胞因子的增多。

紅外頻譜對人體皮膚及皮下組織有一定的穿透能力,其光譜能量被組織吸收后主要引起分子動能增加,產生熱效應,使血管擴張、血流加速,可以改善血液循環,消除炎性介質,促進滲出物吸收,達到消腫止痛的輔助治療效果〔7,15～17〕。本研究中,紅外頻譜照射可以輕度的降低模型大鼠血清尿酸水平,緩解關節腫脹程度,改善關節滑膜表層細胞增生、炎性細胞浸潤及纖維組織增生或纖維化等病理變化,抑制血清IL-17a和TNF-α等炎性細胞因子的形成,尤其是明顯降低IL-17a水平。

綜上所述,紅外頻譜照射對高尿酸狀態下由尿酸鈉誘致的大鼠急性痛風性關節炎損傷有一定的改善作用,可減輕炎性關節腫脹,改善關節組織的炎性病理變化,其作用機制可能與抑制血清炎性細胞因子的過量形成有關。