熊果酸抑制CXCL12/CXCR4途徑減輕糖尿病周圍神經病變大鼠的疼痛反應

任思宏 李剛 冉栩 馮周恒

(南充市中心醫院(川北醫學院第二臨床醫學院)麻醉科,四川 南充 637000)

糖尿病周圍神經病變(DPN)是一種與周圍神經功能障礙相關的慢性糖尿病并發癥,是引起糖尿病患者致殘的一個主要原因〔1〕。這種疾病能夠引起糖尿病患者出現灼熱、針扎、蟲爬、觸電等多種疼痛現象,且下肢發病往往多于上肢,痛感會隨著糖尿病時間變長而有所加重,發病率也會相應提高〔2,3〕。目前臨床治療DPN引起的疼痛常采用阿米替林、普瑞巴林及離子通道阻斷劑等藥物,然而這些藥物對DPN疼痛的療效并不顯著〔4〕。熊果酸是存在于女貞子、芭蕉葉、車前草、山楂等植物中的一種重要成分。研究證明,熊果酸及其衍生物具有多種生物功效,如抑菌、抗炎、抗氧化、抗糖尿病等,它能夠提高胰島素敏感度、調節糖脂代謝紊亂,對代謝綜合征及相關并發癥有較好的改善和緩解效果〔5,6〕。CXC趨化因子配體(CXCL)12與受體趨化因子CXC基序受體(CXCR)4特異性結合后,在神經病理性疼痛、炎癥痛、癌痛等慢性疼痛中起到重要作用〔7,8〕。本研究探討熊果酸是否能夠通過抑制CXCL12/CXCR4途徑減輕DPN大鼠的疼痛反應。

1 材料與方法

1.1實驗動物 6～8周齡雄性SPF級SD大鼠,體質量(200±20)g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號:SCXK(京)2016-0011。

1.2主要試劑與儀器 熊果酸購于北京凱詩源生物科技有限公司(SC11305);鏈脲佐菌素(STZ)購于北京索萊寶科技有限公司(S8050);AMD3100(CXCR4拮抗劑)、兔抗CXCL12、兔抗CXCR4、兔抗β-actin和山羊抗兔IgG購于Abcam公司(ab120718、ab25117、ab124824、ab179467、ab205718)。三諾GA-3型血糖儀購于上海榕柏生物技術有限公司(WD-0228);Von Frey纖毛刺激針購于上海玉研科學儀器有限公司;熱痛敏刺激及測量系統購于意大利Commat公司。

1.3DPN模型構建與藥物處理 大鼠適應1 w后,隨機分組:正常組、DPN組、熊果酸低、中、高劑量組、AMD3100組。除正常組給予普通飼料外,其他各組給予高糖高脂飼料喂養。大鼠喂養4 w后,禁食12 h,正常組腹腔注射與DPN組相同體積檸檬酸緩沖液,其他各組腹腔注射濃度為1% STZ溶液(STZ溶液使用0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液配制)。注射72 h后,檢測空腹血糖,血糖濃度≥16.7 mmol/L可認為大鼠糖尿病模型構建成功。2 w后檢測糖尿病大鼠機械痛覺和熱痛覺情況,痛閾降低幅度>20%基礎痛閾的大鼠可認為DPN模型構建成功〔9〕。DPN模型構建完成后進行藥物處理,熊果酸低、中、高劑量組分別灌胃15、30、60 mg/kg熊果酸〔10〕,DPN組和正常組灌胃等體積生理鹽水,AMD3100組腹腔注射1 mg/kg AMD3100溶液〔11〕。1次/d,持續12 w。

1.4大鼠一般情況觀察 觀察并記錄大鼠飲食、飲水、排尿情況,查看大鼠反應靈敏度、精神狀態和毛發光澤凌亂度等。

1.5大鼠體質量及血糖檢測 大鼠藥物處理前、藥物處理4、8、12 w(即:給藥0、4、8、12 w)分別進行體質量檢測和空腹血糖檢測。

1.6大鼠足底機械痛閾及熱痛閾值檢測 給藥0、4、8、12 w,對大鼠進行足底機械痛閾值和熱痛閾值測定。將大鼠放置在底部為金屬網的玻璃罩中,檢測前大鼠進行30～60 min環境適應。使用Von Frey纖維絲刺激大鼠足底,記錄大鼠出現明顯縮足反應時閾值,檢測5次,取平均值作為大鼠機械痛閾值。使用熱輻射測痛儀測定熱痛閾值,經熱光束刺激大鼠足底中心,記錄大鼠因熱痛而抬足的反應時間。大鼠每側足底均測定5次,每次測定間隔10 min,取10次平均值作為熱痛閾值。

1.7大鼠坐骨神經病理學觀察 大鼠給藥12 w后處死,取1 cm兩側坐骨神經,放入多聚甲醛固定24 h,24 h后經沖洗、無水乙醇脫水、石蠟包埋后制成2 μm切片,進行蘇木素-伊紅(HE)染色后,通過光學顯微鏡觀察坐骨神經病理變化。

1.8大鼠脊髓組織中CXCL12、CXCR4蛋白表達檢測 大鼠給藥12 w后處死,取脊髓組織使用生理鹽水沖洗后,放入-80 ℃保存。進行檢測時取出,液氮中研磨后,使用RIPA試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒分別提取總蛋白、檢測蛋白濃度并計算蛋白上樣量。經十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后,半干轉印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上;經5%脫脂奶粉封閉1 h后;分別加入一抗兔抗CXCL12、CXCR4、β-actin(1∶500),4 ℃孵育過夜;加入二抗(1∶5 000),室溫下孵育1 h。通過化學發光法檢測,Tanon軟件拍攝圖像并進行半定量分析。

1.9統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析,組間多重比較行SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組一般情況 正常組飲食、排尿正常,反應靈敏,精神活躍,毛發順滑有光澤。DPN組飲食、排尿明顯增加,反應遲緩,精神萎靡,毛發雜亂。與DPN組比較,熊果酸低、中、高劑量組和AMD3100組精神和行動都有改善,飲食和排尿無明顯差異。

2.2各組不同時間體質量和血糖變化 給藥0、4、8、12 w,與正常組比較,DPN組體質量明顯下降,空腹血糖明顯升高(P<0.05);與DPN組比較,熊果酸低、中、高劑量組及AMD3100組體質量、空腹血糖無明顯差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組不同時間體質量、空腹血糖變化

2.3各組不同時間足底機械痛閾值、熱痛閾值變化 給藥0、4、8、12 w,與正常組比較,DPN組機械痛閾值和熱痛閾值明顯降低(P<0.05)。給藥4、8、12 w,與DPN組比較,熊果酸低、中、高劑量組及AMD3100組機械痛閾值和熱痛閾值明顯升高(P<0.05),且熊果酸對大鼠機械痛閾值和熱痛閾值的提高作用存在劑量效應關系(P<0.05);與熊果酸高劑量組比較,AMD3100組機械痛閾值和熱痛閾值無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組不同時間足底機械、熱痛閾值變化

2.4各組坐骨神經病理變化 通過光學顯微鏡觀察到,正常組坐骨神經排列整齊、均勻、緊密,神經纖維髓鞘層次清晰、結構有序;DPN組坐骨神經明顯排列稀疏混亂、無規則,神經纖維髓鞘寬度增加、分布勻稱度較差,板層排列紊亂、有分離,少量血旺細胞出現變性壞死現象;熊果酸低、中、高劑量組及AMD3100組與DPN組比較,上述不良變化獲得一定程度改善,尤其是熊果酸高劑量組和AMD3100組,神經排列緊密有序,髓鞘分布均勻。見圖1。

圖1 各組坐骨神經病理(HE染色,×400)

2.5各組脊髓組織CXCL12、CXCR4蛋白表達變化 與正常組比較,DPN組脊髓組織中CXCL12、CXCR4蛋白表達明顯升高(P<0.05)。與DPN組比較,熊果酸低、中、高劑量組及AMD3100組CXCL12、CXCR4蛋白表達明顯降低(P<0.05),且熊果酸對CXCL12、CXCR4蛋白表達的抑制作用存在劑量效應關系(P<0.05)。AMD3100組與熊果酸高劑量組CXCL12、CXCR4蛋白無明顯差異(P>0.05)。見圖2、表3。

1～5:正常組、DPN組、熊果酸低劑量組、熊果酸中劑量組、熊果酸高劑量組、AMD3100組圖2 各組脊髓組織CXCL12、CXCR4蛋白表達水平

表3 各組脊髓組織CXCL12、CXCR4蛋白表達水平比較

3 討 論

DPN疼痛嚴重影響了患者的正常生活,給患者的身心造成了極大傷害。研究發現DPN疼痛與糖尿病患者體內代謝紊亂、神經系統炎癥及微循環障礙等原因有關〔12,13〕。目前治療DPN疼痛采用的藥物主要是鎮痛、抗抑郁和抗驚厥類〔14〕,然而這些藥物效果不盡人意。故而尋找更好的治療藥物是現在急需解決的問題。本研究結果提示,熊果酸能夠減輕或緩解DPN大鼠疼痛反應,能夠通過改善神經系統結構,抑制大鼠疼痛。另外,熊果酸對DPN大鼠體質量和血糖無明顯影響,這與劉星玥等〔9〕、陳波等〔4〕對糖尿病大鼠神經病理性疼痛的研究結果一致。

CXCL12主要來源于神經膠質細胞,在免疫細胞生存、腫瘤細胞生長轉移等方面具有重要作用,CXCR4作為CXCL12特異性受體,參與調節神經系統相關功能,在淋巴細胞、腫瘤細胞等細胞中廣泛表達〔15,16〕。當CXCL12、CXCR4二者特異性結合時,能夠活化其下游多種信號通路,如核轉錄因子、絲裂原活性蛋白激酶等,在神經系統發育及功能調控等方面有重要意義〔17〕。CXCL12結合CXCR4,一方面可通過活化外周傷害性感覺神經元,導致痛覺敏化,另一方面,可通過提高ERK蛋白磷酸化、NLRP3炎癥小體活化等,引發痛覺敏化,導致機體出現疼痛反應〔18～20〕。本研究結果提示,熊果酸可能通過降低CXCL12和CXCR4蛋白表達,減少CXCL12與CXCR4特異結合,抑制其活化感覺神經元,減弱痛覺敏化。此外,本研究進一步表明,熊果酸減輕DPN大鼠疼痛反應可能與抑制CXCL12和CXCR4蛋白表達有關。