脂多糖配合腹腔神經叢阻滯調控HSP70對老年宮頸癌大鼠的干預效果及作用機制

馬曉俞 申華素 王平 劉微 吳振

(1石家莊市第四醫院麻醉科,河北 石家莊 050011;2河北醫科大學第四醫院麻醉科)

宮頸癌是發生于移行帶鱗-柱狀上皮細胞交界處或宮頸陰道部位的惡性腫瘤,其發病率在婦科癌癥疾病中位列第二,且該疾病發病人群逐漸年輕化,對女性的生命健康造成嚴重危害〔1,2〕。傳統的宮頸癌治療主要是放療、手術、化療等,上述方式對患者機體免疫會造成嚴重損傷,且不良反應較多,在臨床應用中也較為受限。脂多糖可以有效激活機體免疫系統,對炎性反應及免疫應答有重要影響,同時也會作用于神經遞質傳遞及細胞因子的表達〔3,4〕。癌癥患者會存在不同程度的疼痛,宮頸癌患者雖然在三階梯治療中癌痛可以得到緩解,但使用的非甾體抗炎藥物、阿片類的毒副作用較為明顯。熱休克蛋白(HSP)70與腫瘤細胞的凋亡、分化有密切聯系,在機體中屬于較為重要的細胞保護因子,可以有效緩解癌組織損傷〔5〕。本文探究脂多糖配合腹腔神經叢阻滯調控HSP70對老年宮頸癌大鼠的干預效果及作用機制,以期為宮頸癌的治療提供一定借鑒。

1 材料與方法

1.1研究動物 選取18月齡的SPF健康雌性SD老年大鼠40只,由北京維通達生物技術有限公司提供,動物許可證號:SCXK(京)2020-0001。大鼠均置于動物飼養室內,保證室內光線充足,溫度保持在(23.03±2.06)℃,通風良好,晝夜節律為12 h,相對濕度保持在50%～60%,定期消毒、清掃鼠籠,及時更換墊料,讓其自由攝食放置的實驗飼料及清潔水,保持1 w適應性飼養時間。

1.2主要試劑 脂多糖(上海生物科技有限公司);80-2型低速離心機(上海研卉生物科技有限公司);DM500型光學顯微鏡(廣州達暉生物技術股份有限公司);Ap22Speedy全自動酶免分析系統(上海吉盛醫學科技有限公司)。FACSCanto Ⅱ流式細胞儀(美國BD公司);羅哌卡因(自碧云天生物有限公司)HSP70 RNA小量提取試劑盒(批號:R4111-02,廣州美基生物科技有限公司);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(批號:GV360321,上海一基實業有限公司)。

1.3方法 適應性飼養,將40只大鼠其隨機分為4組,每組各10只,分別為對照(A)組、宮頸癌模型(B)組、脂多糖(C)組、脂多糖+腹腔神經從阻滯(D)組。應用大鼠右前腋下接種宮頸癌細胞U14的方法對B、C、D組建模,取0.2 ml宮頸癌細胞懸液接種至大鼠右前腋下,待大鼠產生顯著腫瘤結節,其直徑超過1 cm后表示建模成功。從實驗的第6周C、D組大鼠向腹腔注射脂多糖藥物(1 mg/kg),其他兩個組注射同體積的生理鹽水,連續給藥1 w。與此同時,D組利用Matrx 3000VIP小動物麻醉機注射羅哌卡因,首先對大鼠注射1.2%異氟醚吸入麻醉,0.4～0.6 L/min,然后將大鼠置于手術臺,使其足心向上,后肢伸展,向大鼠腹腔神經叢注射0.1 ml 0.5%羅哌卡因。注射5 s后出針。

1.4指標觀察

1.4.1樣本采集 給藥周期滿6 w后,對大鼠進行麻醉,向其腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg),主動脈取血5 ml,以4 000 r/min轉速離心15 min,分離血清后分裝于-70 ℃冰箱保存。處死大鼠,取出其宮頸癌組織,將組織置于生理鹽水中沖洗,最后放置于4%的多聚甲醛溶液中固定。

1.4.2病理組織學觀察 將固定后的宮頸癌組織進行常規脫水、包埋、切片、HE染色,觀察宮頸癌組織病理形態變化。

1.4.3腫瘤重量和腫瘤體積 處死大鼠后,剝離出腫瘤組織,計算體積,同時稱取腫瘤重量,腫瘤體積、(長徑×短徑)/2。

1.4.4免疫性T細胞亞群 使用流式細胞儀檢測大鼠血清中CD3+、CD4+、自然殺傷性T(NK/T)細胞、CD8+水平。

1.4.5疼痛介質水平 采用酶聯免疫吸附試驗檢測各組大鼠疼痛介質P物質(SP)、5-羥色胺(HT)、γ氨基丁酸(GABA)水平,設置空白對照、樣品孔及標準孔,將血清標本分別添加其中,在標準孔中再加入50 μl過氧化物酶標記抗體,在樣品孔中加入40 μl稀釋液及50 μl過氧化物酶標記抗體,空白孔不做處理。于室溫中孵育1 h,洗滌3次后靜置60 min,然后加入底物,在37 ℃環境中孵育15 min,最后由紫外線分光光度儀測定吸光值。

1.4.6HSP70相對表達 采用實時定量聚合酶鏈反應(Real Time PCR)法檢測HSP70表達,HSP70上游引物序列:5′-ATCCAGTGTTCCGTTTCCAG-3′;下游:5′-GTAGCTCACCTGGACCTTG-3′。Real Time PCR檢測HSP70:取200 μl血清樣本,以病毒DNA提取試劑盒提取血清DNA,用Bio-Rad CFX96實時熒光定量PCR儀檢測。反應體系為:上游引物和下游引物(20 pmol/L)各1 μl、DNA模板2 μl和8.5 μl滅菌超純水。擴增條件為:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,95 ℃ 10 s,40個循環。反應結束后確認擴增曲線、熔解曲線,記錄HSP70的Cq值。

1.5統計學處理 采用SPSS20.0統計軟件進行方差齊性檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1病理組織學觀察 如圖1所示,A組宮頸組織正常,結構完整,細胞排列較為整齊、規則;B組宮頸組織細胞排列十分紊亂,產生炎性細胞浸潤,腫瘤細胞核深染,變大,核分裂多;C組、D組宮頸組織炎性細胞浸潤程度降低,癌組織壞死情況得到改善,D組改善效果更佳。

圖1 各組病理組織學(HE染色,×400)

2.2腫瘤重量和腫瘤體積的比較 如表1所示,與B組相比,C組、D組腫瘤重量降低、腫瘤體積縮小,差異具有統計學意義(P<0.05);與C組相比,D組腫瘤重量降低、腫瘤體積縮小,差異具有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組腫瘤重量和腫瘤體積及血清CD3+、CD4+、NK/T細胞、CD8+、HSP70表達比較

2.3免疫性T細胞亞群分布比較 如表1所示,與A組相比,B組、C組、D組CD3+、CD4+、NK/T細胞水平降低,CD8+水平升高,差異具有統計學意義(P<0.05);與B組相比,C組、D組CD3+、CD4+、NK/T細胞水平顯著升高,CD8+水平顯著降低(P<0.05);與C組比較,D組CD3+、CD4+、NK/T細胞顯著升高,CD8+顯著降低(P<0.05)。

2.4HSP70相對表達比較 與A組相比,B、C、D組HSP70相對表達明顯降低(P<0.05);與B組相比,C組、D組HSP70相對表達明顯升高,且D組升高水平明顯優于C組(P<0.05)。見表1。

2.5各組血清中疼痛介質含量比較 如表2所示,與A組相比,B、C、D組SP、5-HT、GABA水平明顯升高(P<0.05);與B組相比,C組、D組SP、5-HT、GABA水平明顯降低,D組降低水平明顯優于C組,差異具有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組血清中疼痛介質含量比較

3 討 論

在宮頸癌發病早期介入手術治療效果較為理想〔6〕。但由于宮頸癌病情發生發展十分隱匿,大部分宮頸癌患者發現疾病時已經到了中晚期,喪失了最佳的手術時間,因此治療宮頸癌的主要手段就是依賴化療,但長期的研究發現,臨床中即使化療藥物可以對腫瘤細胞有抑制作用,但其不良反應也會給患者帶來嚴重影響,不利于患者依從性的提升〔7,8〕。

在革蘭陰性菌的細胞壁中,最為主要的物質就是脂多糖,其會通過調控相關蛋白來參與機體免疫及炎癥反應過程〔9〕。有研究顯示,脂多糖可對機體免疫性損傷產生保護效應,會參與惡性腫瘤的發生發展,對機體有一定的保護性交叉耐受〔10,11〕。另外,脂多糖也可通過調控相關因子發揮神經保護作用〔12〕。腹腔神經叢阻滯指的是將局部麻醉藥物注入神經節結締組織中,最終組織神經節所支配的區域,這種方法可以有效緩解機體多個系統、多個部位中疼痛類疾病〔13〕。相關研究證實,腹腔神經叢阻滯對機體多系統都有雙向調節作用,其治療手段疾病上會遍及機體全身,且治療范圍十分廣泛〔14〕。HSP70是一種在機體產生熱應激反應時產生的應激類蛋白,該蛋白在癌癥的發病及相關治療中一直發揮“雙刃劍”的作用〔15〕。HSP70遍布細胞內外,HSP70在細胞內會幫助腫瘤細胞完成免疫,同時會參與炎癥反應,對疼痛介質有一定干擾作用。細胞外HSP70則會誘導腫瘤產生強烈的免疫效應〔16〕。

本研究結果提示,脂多糖配合腹腔神經叢阻滯可有效緩解癌組織壞死情況,其作用機制可能是通過調控HSP70,在熱效應作用下令腫瘤細胞壞死,發揮抗腫瘤作用,延緩了老年宮頸癌大鼠的生存時間。

T淋巴細胞亞群屬于機體抗腫瘤的重要免疫亞群,其水平變化可以反饋機體整體免疫功能〔17〕。本研究提示,脂多糖配合腹腔神經叢阻滯可改善老年宮頸癌大鼠機體免疫功能,發揮免疫抑制作用,提升抗腫瘤效果。癌癥所引發的疼痛會累及多個部位,當下并不能對癌痛完全控制。癌痛的產生離不開疼痛介質的異常分泌、合成,在宮頸癌發病過程中,SP、5-Ht、GABA屬于最為常見的疼痛介質〔18〕。本研究結果提示,注射脂多糖配合腹腔神經叢阻滯會有效緩解宮頸癌癌痛,其可能是兩者聯合調控HPS70蛋白并進而抑制疼痛介質有關。

既往研究顯示,HPS70會激活巨噬細胞及自然殺傷細胞,促進抗癌細胞因子的釋放,發揮機體特異性免疫〔19,20〕。本研究結果顯示,注射脂多糖配合腹腔神經叢阻滯的老年宮頸癌大鼠HSP70相對表達升高水平更顯著,可以推測,脂多糖配合腹腔神經叢阻滯會促進HSP70水平的升高,激活HSP70與之相關的反應體系,HSP70的上調則會促進T細胞識別,提升機體免疫功能,同時,HSP70也對神經系統有一定保護作用,抑制疼痛介質活化作用的發揮。同時,HSP70對正常機體細胞有保護作用,可有效防止腫瘤細胞大范圍的增殖,促進其凋亡,改變腫瘤細胞代謝、加強DNA修復等。

綜上所述,脂多糖配合腹腔神經叢阻滯可能會通過上調HSP70,改善宮頸癌機體免疫細胞及疼痛介質水平,發揮抗腫瘤的作用,從而提升了淋巴細胞活力,緩解了癌痛,最終有利于宮頸癌機體生存時間的延長,具體機制還需進一步深入研究探索。