不同濃度芒果素單鈉鹽對脂肪乳引起的高脂血癥大鼠血脂代謝的影響

王樹根 寧美英 楊曉暉 李夢冉 馬曉迎 李然

(1滄州市中心醫院藥學部,河北 滄州 061000;2滄州醫學高等專科學校實驗中心;3滄州師范學院生物系)

1 資料與方法

1.1材料 膽固醇、膽酸鈉(天津市光復精細化工研究所),丙基硫氧嘧啶(薩恩化學技術(上海)有限公司),吐溫 80(上海麥克林生化有限公司),豬油(臨沂新程金鑼肉制品有限公司),TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所),4%中性甲醛溶液、蘇木素、曙紅Y(北京索萊寶科技有限公司),TIANScript RT KIT、SuperReal PreMix Plus(生物工程上海有限公司),ROX Reference Dye(廣州碩恒生物科技有限公司),Trizol(Invitrogen),高效切片石蠟(上海華永石蠟有限公司)其他化學試劑(天津市科密歐化學試劑有限公司),MG-Na(實驗室自制,純度≥95%),普羅布考片(250 mg,頸復康藥業)。

1.2儀器與設備 RBP-1B型光電法鼠尾血壓測定分析系統(中日友好醫院),MICROM HM 325 scientific型石蠟切片機、Thermo Fisher Scientific石蠟包埋機(美國賽默飛),ZEISS Primo Start型顯微鏡(德國蔡司),AU480型全自動生化分析儀(美國 Beckman Coulter 公司),ZL6000C型全自動血流變測試儀(北京眾馳),79HW-1 恒溫磁力攪拌器(江蘇金成實驗儀器有限公司),電子天平(上海精其),DYY-Ⅲ-8B 穩壓穩流電泳儀(上海納識生物),GDS凝膠成像分析系統(法國 Bio-Profil)Step One Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems),Multiskan MK3 酶標儀(Thermo Fisher Sci entific 公司)。

1.3實驗動物 SD大鼠60只,雄性,體質量(200±20)g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司〔SCXK(京)2016-0006〕。飼養于滄州醫學高等專科學校實驗動物中心〔SYXK(冀)2019-006〕,飼養環境屏障級。所有操作符合滄州市中心醫院倫理委員會要求〔意見號:2021-174-01(Z)〕。

1.4脂肪乳劑制備 取豬油攪拌在燒杯中攪拌加熱,待溫度升到 100 ℃時,依次加入膽固醇、丙硫氧嘧啶,三者比例為5∶2∶0.2,充分攪勻,然后加適量入吐溫-80,制成油相。同時在另一燒杯中加入蒸餾水和丙二醇二者比例為3∶2,放在電爐上加熱至60 ℃,然后加入適量去氧膽酸鈉,充分攪拌直到完全溶解,制成水相。然后將水相與油相按照2∶1的比例充分混勻,即制成脂肪乳劑〔11〕。灌胃造模時將配好的脂肪乳劑與雙蒸水1∶1稀釋。

1.5分組、造模及給藥 所有SD大鼠在屏障級環境下,基礎飼料應性喂養1 w。將60只SD大鼠稱重標記后隨機分為正常組、模型組、陽性對照組、MG組、MG-Na低劑量組、MG-Na高劑量組,每組10只。正常組基礎飼料喂養直至實驗結束。其余各組在基礎飼料喂養的同時采取脂肪乳灌胃法建立大鼠高血脂模型,灌胃容積為1 ml/kg,1次/d,連續喂養8 w〔11〕。造模同時灌胃給藥,分別為陽性對照組(普羅布考片500 mg/kg)、MG組(80 mg/kg)、MG-Na低量組(40 mg/kg)及高劑量組(80 mg/kg)。正常組及模型組給予同體積的蒸餾水灌胃。

1.6體質量變化 末次給藥后,稱量各組大鼠體質量并記錄。

1.7大鼠尾動脈收縮壓測定 于實驗第4、8周末次給藥后60 min,將大鼠至于(37±0.5)℃恒溫箱30 min,使大鼠尾動脈擴張后連接鼠尾血壓測定分析系統。待大鼠行為穩定后,打開測定分析系統,測定大鼠尾動脈收縮壓,連續測3次,每次間隔約1 min,以均值作為收縮壓值。

實踐教育基地建設是不僅將學校資源與企業資源相融合，充分發揮各自的優勢，每一個需要，合作是雙贏的，也是符合我們學校建立“三位一體”人才培養模式，即：“學校，企業，研究機構”三位一體的教育主題?“，“常識科，專業課程，職業課程”Trinity課程體系，“學習，使用和創造”三位一體的培訓方法。這種方法在促進學校，教師，學生和企業方面發揮了積極作用。“教學與學習緊密結合，理論與實踐緊密結合，學校與企業緊密結合”教育模式積極適應并大力發展人才就業市場，創造本土應用型創新型人才模范。

1.8血清血脂水平檢測 于實驗第8周末次給藥后,大鼠禁食不禁水12 h后,眼眶后靜脈叢采血約1 ml,血樣經室溫靜置,自然凝固,低溫離心(4 ℃,3 000 r/min,10 min)等預處理后取上層血清按照TC、TG、HDL-C、LDL-C試劑盒說明操作檢測。

1.9血清氧化應激指標SOD和MDA檢測 按照1.8中方法大鼠取血,血樣預處理后取上層血清按照SOD和MDA試劑盒說明操作檢測。

1.10血液全血黏度檢測 大鼠麻醉后,用肝素抗凝采血管下腔靜脈取血,4 h內檢測高(黏度200/s)、中(黏度100/s)、低(黏度30/s)3個切值下全血黏度。

1.11肝組織病理學檢查 大鼠麻醉后,經斷頸處死動物,取出整個肝臟并去除包膜,濾紙吸干血液,稱全肝質量即肝濕質量。肝臟指數(%)=肝濕質量/體質量×100%。用甲醛溶液將取出肝臟固定,用刀片切取3～5 mm邊緣齊整的組織經梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、組織切片、常規脫蠟、HE染色、脫水及封片后,在光學顯微鏡下觀察、攝像。

1.12主動脈油紅O染色觀察 固定住大鼠頭尾,沿主動脈方向慢慢地縱向剪開,邊剪邊固定,最終使主動脈整個內腔面平鋪朝上。用現配好的油紅O溶液對主動脈內腔面進行染色,經75% 乙醇浸洗后用數碼相機拍攝圖像。

1.13定量PCR法檢測血管組織中細胞間黏附因子(ICAM)-1和血管細胞黏附因子(VCAM)-1 mRNA表達 用Trizol提取血管組織中的總RNA,測定其濃度。TIANScript RT KIT進行反轉錄制備cDNA。以β-肌動蛋白(actin)為內參。配制反應混合液,總反應體系20 μl:SuperReal PreMix Plus 10 μl,上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μl,cDNA 100.0 ng,ROX Reference Dye 0.4 μl使用RNase-Free ddH2O稀釋至20 μl。反應條件:95 ℃ 15 min;在按照95 ℃ 10 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,循環40次。每個樣品進行3次平行,采用2-ΔΔCt法進行數據的相對定量分析。PCR引物設計:ICAM-1正義鏈:GGCAGCCTCTTATGTTTAT、反義鏈:GCTTGTCCCTTGAGTTTTA,94 bp;VCAM-1正義鏈:AACCTGACCTGCTCAAGTG,反義鏈:CTCTTTGACGCTCTTAGATG,113 bp;β-actin正義鏈:GGCACCACACCTTCTAC,反義鏈:CTGGGTCATCTTTTCAC,108 bp。

1.14Western印跡檢測血管組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白表達 提取樣本組織蛋白樣品,通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白質樣品進行分離。轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色成像。Qantity One分析灰度值和定量分析。

1.15統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行方差分析,兩組比較采用LSD-t法。

2 結 果

2.1各組日常觀察 實驗期間各組未出現死亡。其中,正常組精力充沛、對外界刺激反應良好,毛發具有光澤;其余組實驗初期活動正常,隨著實驗進行大鼠活動顯著減少、精神萎靡,形體肥胖,毛發油膩、缺少光澤;陽性對照組、MG組及MG-Na給藥組生活狀態與形體較模型組好。

2.2各組體質量及肝臟指數變化 經過8 w的實驗喂養與給藥,與正常組比較,模型組體質量、肝臟指數明顯升高(P<0.01)。與模型組比較,MG-Na高、低劑量組與陽性對照組體質量、肝臟指數明顯下降(P<0.05,P<0.01)。見表1。

表1 各組體質量及肝臟指數、變化

2.3各組尾動脈收縮壓變化 采取脂肪乳灌胃,建立大鼠高血脂模型。與正常組比較,實驗4、8 w后模型組尾動脈收縮壓明顯升高(P<0.01)。與模型組比較,MG-Na高劑量組與陽性對照組收縮壓明顯下降(P<0.01)。見表1。

2.4各組血清血脂變化 經過8 w的實驗喂養與給藥,與正常組比較,模型組血清血脂變化顯著(P<0.01),與模型組比較,MG-Na高劑量組、陽性對照組TC、TG、LDL-C明顯降低,HDL-C顯著升高(P<0.01)。見表1。

2.5各組血清氧化應激指標SOD和MDA變化 經過8 w的實驗喂養與給藥,與正常組比較,模型組血清氧化應激指標SOD顯著降低,MDA顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,陽性對照組與MG-Na高劑量組SOD明顯升高,MDA明顯降低(P<0.01)。見表2。

表2 實驗8 w后各組SOD、MDA、全血黏度變化

2.6各組全血黏度變化 經過8 w的實驗喂養與給藥,與正常組比較,模型組在高(黏度200/s)、中(黏度100/s)、低(黏度30/s)3個切值下全血黏度明顯增加(P<0.01,P<0.05)。與模型組比較,MA-Na高劑量組與陽性對照組3個切值下全血黏度顯著降低(P<0.01)。見表2。

2.7各組肝組織病理學變化 經過8 w的實驗喂養與給藥,剖取各組大鼠肝臟。通過外觀觀察,正常組肝無異常變化,外觀顏色鮮紅,無脂質積聚在肝臟表面。與正常組比較,模型組肝臟膨大,包膜緊張,邊緣棱角消失,表面油膩,成奶黃色。與模型組比較,各給藥組肝臟外觀紅潤,肝臟膨大程度減輕,其中陽性對照組與MG-Na高劑量組改善明顯。見圖1。正常組肝細胞結構正常,排列整齊,核深染,居于正中分界清楚,肝細胞未見病理性改變。模型組肝細胞體積增大,細胞結構破壞,細胞內大面積脂肪病變,核居于一側,肝臟細胞匯管區內可見炎性細胞浸潤,甚至出現壞死;胞質內充滿大量脂肪空泡,酷似泡沫細胞,界限不清。陽性對照組及MG-Na高劑量組肝細胞內匯管區炎細胞浸潤減輕,范圍明顯減小。見圖2。

圖1 各組肝臟外觀

圖2 各組肝組織病理(HE染色,×200)

2.8主動脈油紅O染色觀察 油紅O與主動脈斑塊中的脂質結合,將斑塊部位染成紅色,通過紅色斑塊的面積可以直接判斷脂肪乳灌胃引起主動脈的病變程度。經過8 w的實驗喂養與給藥,正常組主動脈壁無增厚表面光滑,無明顯主動脈斑塊產生。與正常組比較,模型組主動脈壁增厚且不平整,可觀察到明顯的主動脈斑塊。陽性對照組及MG-Na高劑量組,主動脈斑塊形成明顯減少。見圖3。

圖3 各組主動脈(油紅O染色,100)

2.9血管組織ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達變化 經過8 w的實驗喂養與給藥,與正常組比較,模型組ICAM-1和VCAM-1 mRNA及蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,MG-Na高劑量組與陽性對照組ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達水平明顯下降;MG-Na低劑量組、陽性對照組ICAM-1、VCAM-1蛋白表達明顯降低(P<0.01)。見表3、見圖4。

1～5:正常組、模型組、陽性對照組、MG組、MG-Na低劑量組圖4 各組血管組織ICAM-1和VCAM-1蛋白表達

表3 實驗8 w后各組血管組織ICAM-1和VCAM-1 mRNA及蛋白表達變化

3 討 論

中國心血管病患病人數持續上升,而血脂異常正是心血管疾病的發病基礎〔12〕。高脂血癥,中醫診斷是由于脾虛痰盛、肝脾不調進而引起氣機障礙、水液代謝受阻,恣食肥甘導致痰積血瘀,化為脂濁〔3,13〕。高脂血癥會引起血液黏度升高、血壓升高,加速動脈粥樣斑塊形成,進而引起腦卒中或冠心病等的發生,降低血脂對于預防心血管疾病的發生尤為重要〔2,3〕。臨床上多采用飲食控制或結合他汀類藥物對高血脂進行調節,但此類藥物副作用大,常引起肝腎損害〔4〕。因此,開發天然藥或其衍生物物調節血脂有著化學合成物不可比擬的優勢。

研究發現,黃酮類MG可以提高脂蛋白酶的活性,明顯調節血脂、游離脂肪酸、左旋肉堿等水平〔14〕。前期研究發現,通過成鹽反應,制備的MG-Na的溶解度、生物利用度較MG明顯提高〔10〕。本實驗表明,MG-Na可以有效治療高脂高熱量飲食引起的脂代謝紊亂、血壓升高。MG-Na保留了MG的多個酚羥基,這種多酚羥基結構可以直接清除自由基,也可通過絡合鐵和銅離子抑制活性氧和自由基的生成〔5,15〕。SOD是機體內具有抗氧化活性的物質,可以預防因氧化傷害所導致的各種疾病〔3,16〕;MDA是脂質過氧化反應產物,水平高低反映出脂質過氧化程度,水平過高可引起細胞損傷〔3〕。本研究表明,MG-Na具有明顯的抗氧化作用可以降低大鼠自由基水平,調節機體脂肪代謝。

當血液黏度增加時,血液流動速度減慢,由于缺氧導致血管內基膜受損,血液中的脂肪更易沉積在血管內壁,使血管內壁結構改變,從而引發動脈粥樣硬化疾病〔9,17〕。實驗結果表明,MG-Na各個劑量可有效地糾正由于高脂血癥引起的血液黏稠度增高且呈劑量相關性,改善高脂血癥引起的血液流變性差的作用。

本研究結果提示,MG-Na可通過降低細胞凋亡,減輕血管炎癥細胞浸潤和斑塊的形成達到保護肝臟及血管的作用。ICAM-1、VCAM-1是存在于細胞表面的一種免疫球蛋白〔18〕。在正常的血管組織中,表達極少,甚至不表達〔19〕。當動脈粥樣硬化發生時,VCAM-1、ICAM-1通過與相應配體相互作用,促進泡沫細胞的形成,加重脂質的沉積,促進單核細胞遷移到血管平滑肌層,進而加劇動脈粥樣硬化進展〔20,21〕。因此,調控ICAM-1和VCAM-1活化,對于防治動脈粥樣硬化具有積極意義。MG-Na能夠顯著降低血管組織ICAM-1和VCAM-1 mRNA的表達,起到保護血管作用、減少斑塊形成,這也通過主動脈油紅O染色觀察得到印證。