基于Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達探討大蒜素對膀胱癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的作用

賈磊 張超 陳俊如 馮岳龍 朱瑞

(寧夏回族自治區人民醫院,寧夏 銀川 750002)

膀胱癌是泌尿系統中最常見的一種惡性腫瘤,大多數為移行細胞癌,具有極高的復發率和死亡率,并且復發后的膀胱癌惡性度增高、浸潤能力增強〔1,2〕。目前多以化療藥物治療為主,但是患者容易產生耐藥性,且更容易復發,因此尋找新的有效的藥物是目前亟待解決的問題。大蒜素具有抗腫瘤、降低膽固醇和血壓、抗血小板聚集、預防心血管疾病、抵抗腫瘤等作用〔3,4〕。并且,隨著研究的不斷深入,發現其對胃癌、宮頸癌、結腸癌等有一定的抑制作用。還有研究指出大蒜素中所含化合物可以加速致癌物的解毒,甚至是誘導細胞凋亡〔5〕。除此之外,B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白(Bax)是調控細胞凋亡的核心分子〔6〕;半胱天冬酶(Caspase)是屬于白細胞介素(IL)-1轉化酶家族的,當細胞識別到凋亡誘導因子的刺激時,Caspase-8將做出應答反應,啟動細胞解體,激活下游Caspase-3促進下游相關靶基因轉錄和翻譯,促進細胞自殺性解體,導致細胞凋亡〔7〕。但是目前關于大蒜素作用于膀胱癌細胞的具體機制并不明確,是否與Bax、裂解的(Cleaved)-Caspase-3蛋白表達有關,尚不清楚,因此本文以膀胱癌細胞為研究對象,探討大蒜素膀胱癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響,并研究其具體機制。

1 資料與方法

1.1材料與儀器 膀胱癌細胞株BIU-87(佰曄生物科技中心);大蒜素注射液(上海禾風制藥有限公司);胎牛血清(FBS)、流式細胞儀(Coming公司);顯微鏡(無陌光學儀器有限公司);噻唑藍(MTT)、離心機(繼譜電子科技有限公司);Matrigel膠、Transwell侵襲室(撫生實業有限公司);所需試劑盒、抗體(晶抗生物工程有限公司);酶標儀、培養箱(風途實力生產廠)。

1.2細胞培養 采用含有胎牛血清的培養基,將細胞置于其中并在二氧化碳(CO2)恒溫培養箱中靜置培養。觀察細胞密度,大約每2 d換1次培養液,7～14 d后倒掉舊的培養液,然后倒入胰蛋白酶液后放入恒溫箱中消化,細胞間隙變大時終止消化并輕柔地吹打細胞,然后接種于新的培養箱中恒溫培養。培養好的細胞將其分為空白對照組和不同濃度的大蒜素組,大蒜素組分別加入50、75、100 mg/L的大蒜素。各組分別設6個復孔。

1.3MTT測定細胞增殖能力 將細胞接種于孔板上,置孔板于37 ℃、5% CO2培養箱24 h后,丟棄上清,藥物組中每個孔加入200 μl DMEM稀釋的不同濃度的藥物培養12 h、24 h、48 h,空白對照組只加入200 μl的DMEM培養,在結束前4 h每孔加入20 μl MTT 5 g/L,4 h后棄上清液,每個孔都加入二甲基亞砜(DMSO),測定吸光值。然后計算。抑制率(%)=(1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡能力 收集細胞,首先采用分10% FBS溶液調整細胞濃度,然后采用洗滌液清洗2次,然后加入胰蛋白酶液消化細胞,在500～1 000 r/min速度下低溫離心5 min,然后加入碘化丙啶(PI)染液在避光條件下進行染色,然后采用流式細胞儀進行檢測。

1.5劃痕愈合實驗檢測細胞遷移 收集細胞后首先用馬克筆在孔板背面劃線標記,然后消化細胞,終止消化后進行離心,然后接入孔板鋪滿,再用槍頭垂直于孔板劃傷細胞,保證劃痕寬度一致,再用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞3次,洗去細胞碎片,在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養,在顯微鏡下分別拍攝0 h及48 h的結果照片。遷移率/%=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.6Transwell實驗測定細胞的侵襲 收集細胞,首先水化基底膜,然后將Transwell小室放入培養板中,吸去剩余培養液,然后消化細胞,終止消化后再離心丟棄培養液,清洗細胞后加入細胞重懸液,然后接種細胞,避免出現氣泡,再將細胞放入培養板中培養48 h,固定后加結晶紫染色液進行染色后再次清洗細胞,在顯微鏡下觀察。

1.7Western印跡檢測細胞內相關蛋白表達 收集細胞,加入裂解液,然后在冰上用刮棒快速將細胞碎片移入離心管中,在4 ℃下以1 200 r/min的速度進行離心,然后采用二喹啉甲酸(BCA)測定細胞總蛋白,再進行灌膠,然后加足夠電泳液進行上樣,然后進行電泳、轉膜,將膜用TBS緩沖液浸濕后搖動封閉1 h,加入稀釋好濃度的一抗抗體;室溫下孵育、脫色后,過夜后同樣方法加入二抗;再次清洗,進行化學發光反應,然后浸入顯影液中顯色、最后凝膠成像。

1.8統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行方差分析,兩兩之間采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1大蒜素對細胞增殖的影響 不同濃度大蒜素對細胞增殖均有抑制作用,且隨著時間和濃度的增長而明顯增長(P<0.05),見表1。大蒜素作用于細胞時,48 h的作用較強,因此后續試驗均研究48 h的結果。

表1 各組細胞增殖能力比較

2.2大蒜素對細胞凋亡的影響 與空白組相比,不同濃度大蒜素組細胞凋亡率明顯較高,且隨著濃度的增高而明顯增高(P<0.05),見表1、圖1。

圖1 各組細胞凋亡

2.3大蒜素對細胞侵襲的影響 與空白組相比,不同濃度大蒜素組侵襲細胞數量明顯較低,且隨著濃度的增高而明顯降低(P<0.05),見表1、圖2。

圖2 各細胞侵襲(結晶紫染色,×200)

2.4大蒜素對細胞遷移的影響 與空白組相比,不同濃度大蒜素組細胞遷移能力明顯較弱,且隨著濃度的增高而明顯減弱(P<0.05),見表1、圖3。

圖3 各組細胞遷移檢測的劃痕實驗(×200)

1～4:空白組、50 mg/L大蒜素組、75 mg/L大蒜素組、100 mg/L大蒜素組圖4 各組細胞Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達

2.5大蒜素對細胞Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達的的影響 與空白組相比,不同濃度大蒜素組Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達明顯較高,且隨著濃度的升高而明顯升高(P<0.05),見表1、圖4。

3 討 論

據統計,每年患膀胱癌的患者將近40萬,而死亡人數可達15萬,近年來,由于診斷水平的完善與提高,發病率有所降低,但該病的死亡率卻一直不下降〔8,9〕。且該病病因較為復雜,又因為特別容易復發和轉移,且早期的癥狀并不明顯,許多患者診斷時已經到了晚期,因此導致治療的效果并不理想〔10〕。目前為止,對該病的治療手段主要是以手術結合化療的綜合方式進行,化療藥物是影響治療結果的關鍵因素,但是許多化療藥物自身存在許多副作用〔11～13〕。因此,積極尋找更加高效的膀胱癌治療方法,提高膀胱癌患者的治療效果、減少復發、改善患者生活質量顯得尤為重要〔14〕。大蒜素又叫大蒜新素,其作用體現在腫瘤細胞的凋上,可被多水平、多靶點誘導,主要作用機制是直接殺傷、抗氧化、特異性阻斷細胞周期、調控癌基因和抑癌基因表達、調節免疫功能、致敏和抗腫瘤藥物耐藥等〔15〕。并且,許多凋亡蛋白與膀胱癌的惡性程度有密切的聯系,Bax蛋白是凋亡通路中的關鍵分子,其過表達可以促進細胞凋亡〔16,17〕。

本研究結果說明,大蒜素可以抑制膀胱癌細胞的增殖、誘導細胞凋亡。有研究提到,大蒜素可以抑制腫瘤生長,誘導癌細胞凋亡,并且已在胃癌和結腸癌中證實了對其癌細胞的殺傷作用〔18〕。本研究證實,大蒜素可以抑制膀胱癌細胞遷移,并且也對藥物濃度有一定的依賴性。黃從兵等〔19〕研究指出,大蒜素在處理膀胱癌細胞時,不同時間均可以抑制細胞增殖,并且可以誘導其發生凋亡。這與本研究結果有一定的相通之處。

有研究用大蒜素處理人黑色素瘤細胞和基底細胞癌細胞,結果顯示二烯丙基二硫能產生活性氧,損傷而激活p53〔20〕;同時增加細胞內鈣離子的濃度,降低線粒體膜電位,使癌細胞阻滯在G2期或M期,從而誘導腫瘤細胞凋亡,認為大蒜素與G2期或M期特異性化療藥物長春新堿聯合使用,不僅可以顯著提高腫瘤的殺傷效果,而且可以降低化療藥物的毒副作用〔21〕。在陳振宇等〔22〕研究中指出,膀胱癌細胞系和膀胱癌中均發現Caspase-6 G49A (E17K)突變。表達突變型Caspase-6的細胞系在生長因子退出的條件下表現出結構性Caspase-6激活。本研究表明,大蒜素可能是通過激活Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達抑制膀胱癌細胞增殖。