香豆素通過調節Keap1/Nrf2/ARE信號通路減輕腦缺血-再灌注大鼠神經損傷

李祥欣 劉義鋒 孫軍 汪寧 劉少哲 白方會 溫昌明 張保朝

(南陽市中心醫院神經內科介入病區,河南 南陽 473000)

腦卒中為臨床最常見的腦血管疾病,發病率逐年上升,且具有高致殘率和高致死率,可分為缺血性和出血性兩大類,以前者居多,約占腦卒中總發病率的80%〔1,2〕。采用機械取栓或靜脈溶栓以盡早恢復血供為治療缺血性腦卒中最有效的手段,但血供恢復后可在短時間內進一步加重腦組織損傷,這種損傷稱之為腦缺血-再灌注損傷(CIRI),其發生機制主要歸于大量自由基累積而超過自身抗氧化清除能力,繼而引發氧化應激損傷〔3～7〕。因此,在恢復血供時輔以有效的抗氧化藥物以提高機體抗氧化能力,從而防治CIRI。香豆素是一類廣泛存在于植物界中的天然有機化合物,具有較強的抗氧化藥理活性,其可減輕因氧化應激而導致的腦損傷〔8～10〕。Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白(Keap)1/核因子E2相關因子(Nrf)2/抗氧化反應元件(ARE)信號通路是機體內重要的抗氧化信號通路,可抵抗氧化應激反應造成的細胞損傷〔11,12〕。然而香豆素是否通過激活Keap1/Nrf2/ARE信號通路而發揮減輕腦缺血-再灌注損傷尚不清楚。本研究通過建立CIRI大鼠模型,觀察香豆素對大鼠神經損傷的影響,并探究Keap1/Nrf2/ARE信號通路作為香豆素藥理機制的可能性。

1 材料與方法

1.1實驗動物 6～8周齡SPF級雄性SD大鼠,體質量200～220 g,購自北京維通利華公司。

1.2試劑與器材 香豆素(貨號102249)購自江蘇永健醫藥公司;Keap1/Nrf2/ARE信號通路抑制劑(ML385,貨號:HY-100523)購自MCE公司;2%2,3,5氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液(貨號R2620)購自北京康瑞納生物公司;蘇木素-伊紅(HE)染色液(貨號DH0006)購自北京雷根生物公司;RIPA蛋白裂解液(貨號BB-3201)購自貝博-Bestbio公司;核蛋白抽提試劑盒(貨號SOS-735)購自北京凱詩源生物公司;二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(貨號PC0020)購自上海吉至生化公司;兔抗鼠一抗抗Keap1、抗Nrf2、抗血紅素氧合酶(HO)-1、抗醌氧化還原酶(NQO)1、抗GAPDH、抗組蛋白(Histone)H3購自Abcam公司(貨號分別為ab227828、ab62352、ab68477、ab80588、ab9485、ab1791);羊抗兔二抗(貨號SN134)購自南京生興生物公司;大腦中動脈阻塞(MCAO)線栓(貨號M8508)購自長沙邁越生物公司;Axygen凝膠成像系統購自廣州科適特科學儀器公司;NIKON TS100倒置顯微鏡購自上海輔澤商貿公司。

1.3實驗分組 將大鼠隨機分為假手術(Sham)組、CIRI模型(CIRI)組,低(2.5 mg/kg)、中(5 mg/kg)、高劑量(10 mg/kg)香豆素組〔13〕,ML385組(30 mg/kg)及ML385+高劑量香豆素組(30 mg/kg ML385+10 mg/kg香豆素),各15只。低、中、高劑量香豆素組,ML385組,ML385+高劑量香豆素組均于造模前連續7 d灌胃給藥,1次/d,Sham組、CIRI組灌胃等量的生理鹽水。

1.4CIRI模型制備 采用線栓法栓塞右側大腦中動脈制備CIRI模型,術前禁食、水8 h,腹腔注射10%水合氯醛麻醉后進行手術。于頸部正中偏右位置剪開皮膚,暴露分離右側頸總、頸外、頸內動脈,用手術線結扎頸總、頸外動脈的近心端,動脈夾夾閉頸內動脈。于距頸總動脈分叉處約4 mm處剪一切口,從切口處緩慢插入線栓進入頸內動脈,感到稍微抵觸時提示線栓前端已阻斷大腦中動脈(插入長度18～20 mm),于缺血2 h后緩慢抽出線栓,完成腦缺血2 h、再灌注24 h的CIRI模型。假手術組不需要插入線栓,其余操作同模型組。于再灌注24 h后檢測相關指標。

1.5Longa5分制法評估大鼠神經行為評分 正常爬行為0分;左側前爪不能完全伸展為1分;向左側旋轉為2分;向左側傾倒為3分;失去意識、不能行走為4分,評分越高表示神經功能缺損越嚴重。重復評定3次取平均值。

1.6TTC染色測量大鼠腦梗死體積 麻醉后行心臟灌流,斷頭取腦,去除小腦、腦干,于-20 ℃冷凍30 min,連續切取6片厚度為2 mm的冠狀位切片,加入2%TTC染色液,于37 ℃避光染色15～20 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后拍照、記錄,借助ImageJ軟件對腦梗死體積進行分析。每組各5個樣本。腦梗死體積(%)=(正常側半腦體積-梗死側非梗死體積)/正常側半腦體積×100%〔14〕。

1.7大鼠腦皮質取材 剩余大鼠麻醉后行心臟灌流,斷頭取腦,去除小腦、腦干,自額葉前端向后取2～4 mm腦組織,進行后續檢測。每組5個樣本用于HE染色,5個樣本用于Western印跡檢測。

1.8HE染色觀察大鼠腦皮質組織病理學變化 4%多聚甲醛固定,石蠟包埋、切片,然后經脫蠟、乙醇梯度脫水、HE染色、封片,于顯微鏡下觀察、拍照。

1.9Western印跡檢測大鼠腦皮質組織中Keap1/Nrf2/ARE信號通路相關因子蛋白水平 采用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白或采用核蛋白抽提試劑盒提取核蛋白,BCA法檢測蛋白濃度。經凝膠電泳分離蛋白、轉印、5%脫脂奶粉封閉后,分別加入兔抗鼠一抗抗Keap1、抗Nrf2、抗HO-1、抗NQO1、抗GAPDH、抗Histone H3,4 ℃過夜,加入羊抗兔二抗,室溫孵育1 h,凝膠成像系統檢測蛋白條帶,借助ImageJ軟件對條帶進行灰度分析。

1.10統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1香豆素對大鼠CIRI 24 h后神經行為評分的影響 與Sham組比較,CIRI組神經行為評分增加,差異有統計學意義(P<0.05);與CIRI組比較,低、中、高劑量香豆素組神經行為評分減少,呈劑量依賴性(P<0.05);ML385組神經行為評分增加,差異有統計學意義(P<0.05);與高劑量香豆素組比較,ML385+高劑量香豆素組神經行為評分增加,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組CIRI 24 h后腦皮質組織中Keap1/Nrf2/ARE信號通路相關因子蛋白水平、神經行為評分及腦梗死體積

2.2香豆素對大鼠CIRI 24 h后腦梗死體積的影響 與Sham組比較,CIRI組腦梗死體積增加,差異有統計學意義(P<0.05);與CIRI組比較,低、中、高劑量香豆素組腦梗死體積顯著減小,呈劑量依賴性(P<0.05);ML385組腦梗死體積顯著增加,差異有統計學意義(P<0.05);與高劑量香豆素組比較,ML385+高劑量香豆素組腦梗死體積增加,差異有統計學意義(P<0.05),見表1、圖1。

1～7:Sham組、CIRI組、低、中、高劑量香豆素組、ML385組、ML385+高劑量香豆素組;圖3同圖1 各組腦組織TTC染色

2.3香豆素對大鼠CIRI 24 h后腦皮質組織病理學的影響 Sham組腦皮質組織未見明顯病理學改變,神經細胞形態與結構正常,排列緊密整齊;CIRI組腦皮質組織可見明顯病理學改變,神經細胞排列稀疏紊亂、組織間隙水腫、核皺縮、壞死等,給予不同劑量香豆素預處理后,神經細胞損傷程度減輕,而給予ML385預處理后,神經細胞損傷程度加重,見圖2。

圖2 各組腦組織(HE染色,×400)

2.4香豆素對大鼠CIRI 24 h后腦皮質組織中Keap1/Nrf2/ARE信號通路相關因子蛋白水平的影響 與Sham組比較,CIRI組腦皮質組織中Keap1蛋白減少,胞核Nrf2/Nrf2及HO-1、NQO1蛋白增加,差異有統計學意義(P<0.05);與CIRI組比較,低、中、高劑量香豆素組腦皮質組織中Keap1蛋白顯著減少,胞核Nrf2/Nrf2及HO-1、NQO1蛋白顯著增加,呈劑量依賴性(P<0.05);ML385組胞核Nrf2/Nrf2及HO-1、NQO1蛋白減少,差異有統計學意義(P<0.05);與高劑量香豆素組比較,ML385+高劑量香豆素組胞核Nrf2/Nrf2及HO-1、NQO1蛋白減少,差異有統計學意義(P<0.05),見表1、圖3。

圖3 Western印跡檢測各組Keap1/Nrf2/ARE信號通路相關因子蛋白表達

3 討 論

香豆素是一類具有強抗氧化應激活性的天然有機化合物,廣泛存在于傘形科、菊科、豆科、菌科等多種植物中〔15〕。香豆素可減少CIRI大鼠腦梗死體積,改善其神經行為評分,發揮對CIRI大鼠的神經保護作用〔16,17〕。本研究結果表明,CIRI模型造膜成功;香豆素可減輕腦缺血/再灌注引發的神經損傷。

Keap1/Nrf2/ARE是機體內重要的抗氧化信號通路,其中Nrf2是發揮抗氧化作用的關鍵因子,在生理條件下,Keap1與Nrf2結合而使Nrf2活性受到抑制,而在應激狀態下,Keap1與Nrf2結合能力下降且同時釋放Nrf2,繼而Nrf2發生核移位與ARE結合,激活下游抗氧化調節酶HO-1、NQO1,以對抗氧化應激,減輕神經損傷〔18～20〕。本研究結果表明,機體可自發地激活Keap1/Nrf2/ARE信號通路以誘發CIRI;香豆素可進一步激活Keap1/Nrf2/ARE信號通路以對抗CIRI。

綜上所述,香豆素可減輕腦缺血-再灌注大鼠神經損傷,可能通過激活Keap1/Nrf2/ARE信號通路而實現。