miR156 調控獼猴桃果實抗壞血酸代謝機制初探

周鈺雯，陳 超，胡晶金，周雨菲，陳思懿，李 旭，*

（1.浙江萬里學院生物與環境學院，浙江 寧波 315100；2.寧波大學科學技術學院/寧波市農業種質資源挖掘與環境調控重點實驗室，浙江 寧波 315212；3.慈溪市坎墩玉蘭果蔬農場，浙江 寧波 315300）

抗壞血酸（L-ascorbic acid，AsA），又名維生素C，是廣泛存在于植物中的小分子抗氧化物質[1]，對植物的生長發育及果實品質的形成具有重要作用，也是維持人類正常生長發育所必需的營養物質[2]。因此，提高果蔬中AsA 含量具有重要的產業意義和應用價值。

獼猴桃是獼猴桃科獼猴桃屬中多年生落葉藤本植物，果實中AsA 含量是梨和蘋果的80～100 倍，享有“水果之王”“VC 之王”的稱號[3]。AsA 高效代謝積累成為獼猴桃果實營養物質的研究熱點。相關研究表明，獼猴桃AsA 生物合成途徑中AcPMM、AcGME2和AcGalLDH基因，循環途徑中AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR和AcAPX基因是調控紅陽獼猴桃果實高AsA 水平的重要基因[4]。獼猴桃果實內外果皮AsA 含量存在顯著差異[5-6]，內果皮AsA 含量顯著大于外果皮，然而內外果皮AsA 差異的生理和分子機制尚不清楚。因此，本研究通過生理生化以及轉基因手段，探究獼猴桃內外果皮AsA 代謝差異的原因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以紅陽獼猴桃果實為試材，采樣時間為2022 年5—9 月，于盛花期后40 d 開始，每隔20 d 采樣1 次，選取大小均勻的無損傷獼猴桃果實，果實分內外果皮，于液氮中磨至粉狀，放入-80 ℃冰箱中保存，用于測定AsA 含量和基因表達量。

1.2 AsA和T-AsA含量的測定

T-AsA 即總抗壞血酸。AsA 和T-AsA 的提取與測定參照張琰等[7]的方法進行。

1.3 總RNA提取及反轉錄cDNA的合成

稱取約0.1 g 獼猴桃果實（分內、外果皮），使用植物RNA 提取試劑盒來提取果實內外果皮總RNA。根據反轉錄試劑盒說明書進行操作。

1.4 小RNA提取及反轉錄

小RNA 提取采用Takara 公司的RNAiso for Small RNA（9753A，Takara，大連，中國）試劑進行提取。采用莖環法設計獼猴桃miR156 和5S rRNA 的反轉錄莖環引物和半定量引物[8]，反轉錄cDNA，通過實時熒光定量檢測miR156 表達量。

1.5 實時熒光定量PCR

采用三步法進行q-PCR 擴增。以獼猴桃AcActin作為內參基因，設置3 個生物學重復，每個基因的相對表達量以2（-ΔCT）方法進行分析。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃果實內外果皮AsA和T-AsA含量差異分析

如圖1 所示，在幼果時期（盛花后40 d），AsA、T-AsA 含量達到最高值，之后隨著果實的生長發育逐漸下降。果實內果皮AsA 含量在花后100 d 趨于穩定，而果實外果皮中AsA 含量在花后80 d 已無明顯變化?；ê?20 d（商業化成熟期）時，內、外果皮中AsA 的含量分別為花后40 d 的29.2%和22.7%。綜上所述，獼猴桃果實發育過程抗壞血酸含量逐漸降低，果實內果皮抗壞血酸含量顯著大于外果皮。

圖1 獼猴桃果實內外果皮AsA 和T-AsA 含量變化

2.2 獼猴桃果實內外果皮AsA合成途徑相關基因表達變化分析

根據前期測定的轉錄組數據，篩選獲得AsA 合成途徑的基因，采用熒光定量PCR 技術，分析6 個AsA合成途徑基因的表達情況。如圖2 所示，在果實生長發育過程，合成基因與AsA 含量水平呈現相似的變化趨勢。果實發育早期即花后40～60 d，果實內果皮中AsA 合成基因轉錄水平顯著高于外果皮。綜上研究結果表明，在AsA 合成途徑中，AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGalLDH、AcGME是導致獼猴桃果實內外果皮AsA 含量差異的關鍵基因且在果實發育早期差異顯著。

圖2 獼猴桃果實內外果皮AsA 合成途徑基因表達

2.3 獼猴桃果實內外果皮AsA循環途徑相關基因表達變化分析

在獼猴桃果實發育的過程，AsA 循環途徑相關基因AcMDHAR1、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR整體上呈現下降趨勢。果實發育后期即花后80～120 d，果實內果皮中AsA 循環途徑基因表達水平顯著高于外果皮（見圖3）。綜上表明，在AsA 循環途徑中，AcMDHAR1、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR是導致獼猴桃果實內外果皮AsA 差異的主要基因且在果實發育后期差異顯著。

圖3 獼猴桃果實內外果皮AsA 循環途徑基因表達

2.4 獼猴桃果實內外果皮miR156表達變化分析

熒光定量PCR 結果顯示（見圖4），miR156 基因的表達水平整體呈下降趨勢，且在整個生長過程中，果實內果皮中miR156 基因含量顯著高于外果皮，在花后120 d 趨于平衡。綜上，獼猴桃果實發育過程miR156 基因的表達和抗壞血酸含量變化基本一致。

圖4 獼猴桃果實生長過程miR156 表達

2.5 轉基因驗證miR156對獼猴桃果實抗壞血酸含量的影響

為了驗證miR156 基因對獼猴桃果實抗壞血酸含量的影響，通過瞬時轉化獼猴桃果實手段進行驗證分析。如圖5(a)所示，35S:MIR156a過表達獼猴桃果實中miR156 表達水平顯著升高，35S:MIM156干擾表達果實中miR156 表達水平顯著降低。如圖5(b)—(c)所示，與對照組相比，T-AsA 和AsA 含量在35S:MIR156a過表達獼猴桃果實中顯著增加，而在35S:MIM156干擾表達果實中顯著減少。綜上，miR156 基因正調控獼猴桃果實中的抗壞血酸含量。

圖5 miR156 對獼猴桃果實抗壞血酸含量的影響

2.6 miR156對抗壞血酸合成和循環途徑基因表達的影響

為了進一步驗證miR156 基因對抗壞血酸的調控作用，利用實時熒光定量PCR 技術測定分析AsA 合成和循環途徑相關基因表達水平。如圖6 所示，與對照組相比，在35S:MIR156a過表達果實中，AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcMDHARI、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR表達水平顯著升高，而在35S:MIM156干擾表達果實中上述基因的表達水平顯著下降，但AcPMM表達水平幾乎不變。綜上，miR156 調控獼猴桃果實中的抗壞血酸合成和循環途徑基因表達。

圖6 miR156 對抗壞血酸合成和循環途徑基因表達的影響

3 討論與結論

獼猴桃果實果實發育過程中，AsA 在幼果時期含量達到最高值，之后隨著果實發育快速下降，這與鐘彩虹等研究結果基本一致。熒光定量PCR 結果表明，果實內果皮miR156 基因表達量顯著高于外果皮。已有研究表明，miR156-SPL 不僅是調控植物幼年到成年階段轉變的核心分子模塊，還參與植物生長發育其他方面，如植株形態建成、質體轉化、生殖發育、果實成熟和脅迫響應等[9]。本研究初步結果明確miR156對AsA 代謝具有調控作用，說明miR156-SPL 分子模塊功能比較豐富。

本研究發現，獼猴桃果實內果皮AsA 含量顯著高于外果皮。在AsA 合成途徑中，AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGalLDH、AcGME是導致獼猴桃果實內外果皮AsA 差異的主要基因且差異主要存在于果實發育早期。在AsA 循環途徑中，AcMDHAR1、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR是導致獼猴桃果實內外果皮AsA 差異的主要基因且差異主要存在于獼猴桃果實發育后期，降解途徑未見差異。瞬時轉基因手段證實miR156 調控獼猴桃果實中的抗壞血酸合成和循環途徑基因表達。