血清蛋白乙酸纖維素薄膜電泳方法的優化

閆巧梅,李 斌,張學明,孔凡青,高英辰,丁海麥

(包頭醫學院,內蒙古 包頭 014040)

0 引言

電泳是指帶電粒子在電場中向與其電性相反方向移動的現象。生物體內的蛋白質、核酸等大分子物質由于分子大小、形狀及所帶電荷不同,在同一電場條件下在介質中移動的速度不同,利用此特點將其分開的技術即電泳技術[1]。依據支持介質不同可分為淀粉凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳、濾紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳等。乙酸纖維素薄膜電泳因對蛋白質樣品吸附極少、快速省時、靈敏度較高,長期以來一直被廣泛用于實驗教學。科學研究及臨床檢驗應用乙酸纖維素薄膜電泳對血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、核酸及其他生物大分子進行分離檢測。血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳受人為操作因素及環境因素影響較大,首次操作經常出現血清蛋白分離效果較差的問題[1]。醋酸纖維素薄膜電泳法分離血清蛋白,原來采用浙江臺州市路橋四甲生化塑料廠生產的乙酸纖維素薄膜,電泳緩沖液pH 8.6、離子強度為0.06 M/L的巴比妥緩沖液進行分離,效果良好,但更換為成都菲爾斯特儀器有限公司的乙酸纖維素薄膜后,再用pH 8.6、離子強度為0.06 M/L的巴比妥緩沖液進行血清蛋白分離,經常存在血清蛋白條帶聚集、分不開的現象,其他使用單位也普遍存在這種情況,故有必要對醋酸纖維素薄膜的實驗方法進行優化。本實驗從緩沖液組成、離子強度、電泳時間及點樣片裝置進行優化,取得了較好、可重復的實驗效果。

1 實驗材料及儀器

1.1 實驗材料

乙酸纖維素薄膜(2 cm×8 cm,成都菲爾斯特儀器有限公司生產),新鮮兔血清。溴酚藍、巴比妥、巴比妥鈉、硼酸、硼砂、氯化鈉、麗春紅S均為國藥集團化學試劑有限公司生產。冰醋酸、無水乙醇為天津凱通化學試劑有限公司生產。

1.2 實驗儀器

醋酸纖維素薄膜電泳儀(北京六一生物科技有限公司生產,型號DYCP-38C),電泳儀電源(BG-Power600K),微量移液器,濾紙,薄塑料片(與蓋玻片厚度相當),培養皿,鑷子,濾紙等。

1.3 實驗試劑

pH 8.6、離子強度0.075 M/L巴比妥緩沖液[2](稱取巴比妥鈉15.45 g,巴比妥2.76 g,用去離子水溶解定容至1000 mL);pH 8.6、離子強度0.025 M/L巴比妥緩沖液(稱取巴比妥鈉5.15 g,巴比妥0.92 g,用去離子水溶解定容至1000 mL)[3];pH 8.6、離子強度0.05 M/L硼酸緩沖液(稱取硼酸6.7 g,硼砂13.4 g,用去離子水溶解定容至1000 mL)[4-5];pH 8.6、離子強度0.08 M/L硼酸緩沖液[2](稱取硼酸5.6 g,硼砂5.61 g,氯化鈉1.32 g,用去離子水溶解定容至1000 mL)。

麗春紅染色液:稱取麗春紅S 0.1 g,溶液5 mL冰醋酸,去離子水溶解定容至100 mL。

漂洗液:量取95%乙醇45 mL,加冰醋酸5 mL,混勻后,用去離子水稀釋至100 mL。

2 實驗方法

準備電泳槽。取4個乙酸纖維素薄膜電泳儀,槽內分別加入4種緩沖液,保證電泳槽內液面高度相等,剪裁尺寸合適的雙層濾紙條,濾紙條一端與電泳槽的支架的前沿對齊,另一端浸入電泳槽的緩沖液內,使濾紙緊貼在支架上,待濾紙全部濕潤后,驅除濾紙與支架間氣泡,便可用于薄膜電泳。

浸膜。將乙酸纖維薄膜磨面朝下,分別置于4種不同緩沖液中,膜自然沉降,至少浸泡30 min,確保薄膜浸透。

血清預處理。吸取200 uL兔新鮮血清,放入500 uL EP管中,用200 uL微量移液器吸頭蘸取少量溴酚藍,再用微量移液器輕輕反復吹打血清,待溴酚藍溶解,血清染成藍色,將預染的200 uL血清吸到玻璃板上,并將血清涂成薄薄一層覆蓋在玻璃板上(厚度約1 mm圖1)。

圖1 預染血清涂成薄薄一層Fig.1 Pre stained serum coated in a thin layer

加樣。用鈍頭鑷子從浸膜液中夾一張乙酸纖維薄膜,用濾紙輕輕吸去醋酸纖維薄膜上多余的緩沖液,磨面朝上,用自制加樣片(厚度與蓋玻片相當的薄塑料片剪成0.6 cm×5 cm,3片疊放在一起用透明膠帶固定,圖2)蘸取玻璃板上血清,在距膜一端1.5 cm處,將血清印在膜上,待樣品滲入薄膜后移開,使其形成具有一定寬度、精細勻稱的矩形,每張膜加2個樣品(圖3)。整個加樣過程盡可能快,保持薄膜始終處于濕潤狀態,印跡可能要小、整齊,避免擴散面積過大。

圖2 自制加樣片Fig.2 Self made sampling piece

圖3 膜加樣后效果Fig.3 Effect of membrane sampling

電泳。將加樣后的薄膜磨面朝下放置于電泳槽支架雙層濾紙上,保證加樣端置于電泳槽陰極端濾紙,薄膜條平直,與濾紙貼緊,用圓珠筆做好標記,蓋好電泳槽蓋,靜止平衡10 min,打開電泳儀電源,將調節電壓調至恒壓100 V,電泳70 min。

染色與漂洗。電泳結束后,將薄膜置于麗春紅染色液中,染色5 min,取出后用漂洗液漂洗3次,每次5 min,直至薄膜背景色為無色,取出用濾紙吸干漂洗液,辨認電泳圖譜中各蛋白區帶。

電泳緩沖液與電泳時間優化。依據上述實驗結果及能否分離出5條區帶,選取理想的緩沖液。恒壓100 V,選取電泳時長為40 min、50 min、55 min的3個時間段,對電泳時間進行優化,保證漂洗后薄膜上可顯現清楚的5條區帶,選擇電泳時長最短的為最佳電泳時長。

3 實驗結果

3.1 電泳緩沖液選擇

按要求加好樣后,蓋好電泳槽蓋,平衡10 min,接通電源,將電壓調到100 V進行恒壓電泳,電泳70 min后,經麗春紅染色5 min,漂洗液漂洗3次,保證將薄膜漂洗成無色,取出用濾紙吸干漂洗液。將乙酸纖維素薄膜放到A4紙上,觀察pH 8.6,離子強度0.075 M/L、0.025 M/L巴比妥緩沖液;pH 8.6,離子強度0.05 M/L、0.08 M/L硼酸緩沖液的電泳圖譜,結果顯示,只有0.08 M/L硼酸緩沖液電泳圖譜能顯示出5條區帶(圖4),而其他3種緩沖液不是蛋白區帶聚集,就是擴散,分辨不出5條區帶。雖然pH 8.6,離子濃度0.08 M/L硼酸緩沖液電泳圖譜能清晰顯示出5條區帶,從左到右依次為γ球蛋白、β球蛋白、α2球蛋白、α1球蛋白、白蛋白。但蛋白區帶γ球蛋白、α1球蛋白存在擴散現象,不利于結果判斷,其原因與電泳時間偏長有關,需對電泳時長進行進一步優化。

1.加樣點;2.γ球蛋白;3.β球蛋白;4.α2球蛋白;5.α1球蛋白;6.白蛋白。圖4 血清蛋白乙酸纖維素薄膜電泳圖譜Fig.4 Serum protein cellulose acetate film electrophoresis pattern

3.2 電泳時間選擇

不同電泳時長對醋酸纖維素薄膜電泳的圖譜有一定的差異。用pH 8.6、離子濃度0.08 M/L的硼酸緩沖液,電泳恒壓100 V,將電泳時長設置為40 min、50 min、55 min 3個時間段進行優化,電泳結束后,經麗春紅染色,漂洗液將薄膜漂洗成無色,取出用濾紙吸干漂洗液,將乙酸纖維素薄膜放到A4紙上,觀察3個時長的電泳圖譜(圖5)。結果顯示,電泳時長為40 min時,α2球蛋白與β球蛋白分離不太明顯;電泳時長為55 min時,γ球蛋白條帶出現擴散,綜合分析電泳時長為50 min時,乙酸纖維素薄膜圖譜上血清蛋白5條帶清晰可辨,結果比較理想。

a.電泳時長40 min;b.電泳時長50 min;c.電泳時長55 min。圖5 血清蛋白乙酸纖維素薄膜電泳圖譜Fig.5 Serum protein cellulose acetate film electrophoresis pattern

4 結果分析與討論

乙酸纖維素是纖維素羥基經乙酰化形成的纖維素乙酸酯,將其溶于丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等有機溶劑后,涂抹成均勻的薄膜則成為乙酸纖維素薄膜,具有細密微孔結構,滲透性強,對電泳物質移動阻力小,對樣品無拖尾及吸附現象。該電泳技術已廣泛應用于血清蛋白、血紅蛋白、糖蛋白、脂蛋白、同工酶的分離及測定中。血清中各種蛋白質的等電點大多低于pH 7.0,在pH 8.6的緩沖液中,均解離成陰離子,在電場中向陽極移動。血清中不同蛋白質所帶電荷、分子大小及形狀各不相同,故在電場中的泳動速度不同,電泳結束后停留在乙酰纖維素膜的不同位置。

緩沖液離子濃度與成分是影響乙酸纖維素電泳的關鍵因素,更換不同廠家薄膜后,應對電泳緩沖液進行優化。目前乙酸纖維素電泳緩沖液主要有pH 8.6的巴比妥緩沖液和硼酸緩沖液,離子強度通常為0.02～0.2 mol/L,緩沖液離子強度越大,樣品的電泳速度減慢,離子強度增加使電泳時的總電流及產熱增加,對電泳不利。更重要的是,巴比妥為麻毒類藥品,存在實驗室安全潛在風險,需尋求替代巴比妥緩沖液。而硼酸及其鈉鹽臨床上可用于生產硼酸軟膏、消毒劑、收斂劑、防腐劑等,安全低毒,是理想的替代品[6]。研究結果表明,實驗室電泳所用乙酸纖維素薄膜用pH 8.6、離子濃度0.08 M/L的硼酸緩沖液完全可以取代巴比妥緩沖,且效果遠優于巴比妥緩沖液。

加樣是影響乙酸纖維素電泳的關鍵因素,蓋玻片或X光片單層吸附血清較差,稍有不慎會造成加樣過多、過少或靠近膜邊緣,電泳圖譜會出現蛋白條帶拖尾、分離不佳或條帶彎曲。加樣前,將預染血清200 uL在玻璃板上涂成薄薄一層(厚度1～2 mm);再用3片疊放在一起的自制加樣片,在薄薄血清中輕輕蘸取一下,加樣片吸附的血清大約1 uL,保證加樣量合適,在膜上印跡后寬度合適均勻。1張膜同時加兩個樣品,可減少膜的使用量,節省實驗成本。

蛋白質乙酸纖維素電泳染色的常用染料有氨基黑10B和麗春紅S兩種,均屬于酸性染料,與蛋白質中的精氨基酸、賴氨基酸等帶正電荷的堿性氨基酸相結合,蛋白質顯示黑色或紅色條帶。

血清乙酸纖維素薄膜電泳實驗想要獲得理想的分離條帶,關鍵是要做到乙酸纖維素薄膜與緩沖液的離子成分與摩爾濃度相匹配,在確保分離效果的前提下,盡可能縮短電泳時間,提升實驗效率。乙酸纖維素薄膜用pH 8.6、離子強度0.08 M/L硼酸緩沖液,電壓100 V,電泳時長50 min,分離兔血清蛋白實驗結果比較理想,能代替巴比妥緩沖液。