潤腸顆粒對小鼠便秘的改善作用及機制 Δ

黃夢琴，王雪松，甘雨涵，盧詩勤，鄧琪琪，朱 青 ，郭 姣（廣東藥科大學中醫藥研究院/廣東省代謝病中西醫結合研究中心/糖脂代謝病教育部重點實驗室/廣東省代謝性疾病中醫藥防治重點實驗室，廣州 510006）

便秘是胃腸道疾病中最常見的類型，其主要癥狀為大便秘結不通、排便時間延長和排便困難。胃腸動力不足及腸道水分和潤滑性黏液分泌紊亂導致的腸道蠕動減弱，是便秘發生的主要原因。便秘不僅給患者的身體和精神帶來困擾，還嚴重影響患者的日常生活和健康。中藥可通過多成分、多靶點和多機制治療便秘等癥，且副作用小，近年來已被廣泛應用于便秘的治療。

潤腸顆粒是廣東藥科大學中醫藥研究院的專利復方中藥制劑，具有益氣養陰的功效，臨床主要用于行氣潤腸通便。該藥由白術、枳實、肉蓯蓉、厚樸、火麻仁、當歸、黃芪、西洋參8 味中藥組成[1]，其中白術和枳實能夠健脾理氣，促進腸道蠕動，提高腸道的運動功能；肉蓯蓉、厚樸、火麻仁、當歸具有潤腸通便的作用；黃芪具有益氣補中的作用；西洋參具有補氣養陰和清熱生津的功效。然而，潤腸顆粒治療便秘的具體作用機制尚未闡明。基于此，本研究利用洛哌丁胺誘導便秘小鼠模型，探討潤腸顆粒對便秘的改善作用并探究其潛在作用機制，旨在為闡明潤腸顆粒的藥效和作用機制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括ASP300S型組織脫水機、RM2235 型石蠟切片機（德國Leica 公司），YB-7LF 型石蠟包埋機（湖北省亞光醫用電子技術有限公司），BX53型光學顯微鏡（日本Olympus 公司），5804R 型冷凍離心機（德國Eppendorf公司），SM i3x型多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司），Light Cycler 480 Ⅱ型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Roche 公司），Universal Hood Ⅱ型高靈敏度化學發光成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 主要藥品與試劑

潤腸顆粒（規格10 g/袋，批號分別為201001、201002、201003）來源于廣東藥科大學中醫藥研究院；鹽酸洛哌丁胺膠囊（規格2 mg，批號KLJOBJ7）購自西安楊森制藥有限公司；枸櫞酸莫沙必利片（規格0.005 g，批號6600C）購自住友制藥（蘇州）有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑（批號1014A21）購自北京雷根生物技術有限公司；阿爾新藍染色試劑盒（貨號G8015-100ml）購自廣州捷倍斯生物科技公司；兔黏蛋白2（mucin 2，MUC2）單克隆抗體和兔重組Tubulin 單克隆抗體（貨號分別為ab272692、ab176560）均購自英國Abcam公司；兔干細胞因子（stem cell factor，SCF）、酪氨酸激酶受體c-kit 多克隆抗體和兔甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（H+L）抗體（貨號分別為AF4113、AF6153、AF7021、S0001）均購自江蘇親科生物研究中心有限公司。

1.3 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠，6～8周齡，體重（20±2）g，購自廣東省醫學實驗動物中心，動物生產許可證號SCXK（粵）2022-0002。本實驗方案由廣東藥科大學實驗室動物護理和使用倫理委員會批準，批準號gdpulacspf2022056。小鼠在光照周期12 h、溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的環境下飼養。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將小鼠隨機分為正常對照組，模型組，潤腸顆粒低劑量組（5 g/kg）、潤腸顆粒高劑量組（10 g/kg）和莫沙必利組（0.003 g/kg，陽性對照），每組6 只。正常對照組小鼠灌胃純水，其余4組小鼠灌胃洛哌丁胺（0.004 g/kg）造模，每天9：00和18：00各灌胃1次，持續灌胃3 d后開始藥物治療，期間造模條件不變[2]。每天上午洛哌丁胺造模結束1 h后，正常對照組和模型組小鼠灌胃純水，各藥物組小鼠灌胃相應藥物，給藥劑量按照前期預實驗結果設置，連續給藥7 d。

2.2 小鼠糞便含水量測定

各組小鼠于給藥第7天后，單獨放于代謝籠中，自由飲食飲水，收集3 h內各組小鼠的糞便，以新鮮的糞便質量作為糞便濕重；隨后將糞便放入60 ℃的烘箱中烘干12 h，以此時稱定的糞便質量作為糞便干重；計算糞便含水量：糞便含水量＝（糞便濕重－糞便干重）/糞便濕重×100%[3]。

2.3 小鼠腸道推進率測定

將阿拉伯樹膠100 g倒入燒杯中，加入純水800 mL，加熱并攪拌，煮沸至透明后，加入活性炭粉末50 g，煮沸后冷卻至室溫，重復3次，加純水定容到1 000 mL，混勻，制得墨汁，備用。在第7天測定小鼠糞便含水量后，將小鼠禁食不禁水16 h，即第8天上午，正常對照組小鼠灌胃純水，其余4組小鼠灌胃洛哌丁胺（0.004 g/kg）。30 min后，潤腸顆粒低、高劑量組小鼠分別按5、10 g/kg灌胃含潤腸顆粒的墨汁，莫沙必利組小鼠按0.003 g/kg 灌胃含枸櫞酸莫沙必利片的墨汁，正常對照組和模型組小鼠灌胃純墨汁。25 min 后立即處死小鼠，取出腸道，并將腸系膜分離干凈，緩慢拉直腸道，以此時測量的腸道長度作為“腸道總長度”，以從幽門的位置到墨汁的前沿位置作為“墨汁推進長度”，計算腸道推進率：腸道推進率＝墨汁推進長度（cm）/腸道總長度（cm）×100%[4]。

2.4 小鼠結腸和回腸組織結構觀察

小鼠取材后，立即將其結腸和回腸組織沖洗干凈，取每只小鼠相同位置的一段結腸和回腸放入包埋盒，置于4%多聚甲醛中24 h，乙醇脫水、包埋、切片，將厚度為4 μm 的石蠟切片進行HE 染色，中性樹脂封片后，置于顯微鏡下觀察小鼠結腸和回腸組織結構變化。

2.5 小鼠結腸黏液分泌量觀察

取厚度為4 μm的小鼠結腸組織石蠟切片進行阿爾新藍染色，然后置于顯微鏡下觀察小鼠結腸黏液分泌量（結腸切片中的藍色部分為小鼠結腸黏液）。

2.6 小鼠結腸組織中c-kit蛋白表達檢測

取厚度為4 μm的小鼠結腸組織石蠟切片，烤片、脫蠟、水化和抗原修復后，用5%山羊血清室溫封閉30 min；加入c-kit 抗體（稀釋比例為1∶500），于4 ℃孵育過夜；用0.02%磷酸鹽緩沖液洗3 次后，再加入二抗（稀釋比例為1∶500），室溫孵育1 h。用DAB 顯色，封片并于顯微鏡下拍照觀察，使用Image-Pro Plus軟件計算5個視野中c-kit陽性染色的面積。

2.7 小鼠結腸組織中炎癥因子和促進腸道運動相關因子mRNA表達檢測

取小鼠結腸組織適量，采用Trizol 法提取RNA，檢測樣品RNA的濃度，按照EZBioscience試劑盒說明書將RNA 逆轉錄為cDNA，用實時定量PCR 儀以GAPDH 為內參，檢測炎癥因子[腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、誘導型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）]、促進腸道運動相關因子[神經型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）、平滑肌肌球蛋白輕鏈激酶（smooth muscle myosin light chain kinase，smMLCK）、5-羥色胺受體4（5-hydroxytryptamine 4 receptor，5-HT4R）、MUC2、SCF、c-kit]mRNA表達水平，采用2－ΔΔCt法進行相對定量分析。引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成，具體序列及產物長度見表1。

表1 引物序列及產物長度

2.8 小鼠結腸組織中MUC2和SCF蛋白表達檢測

取小鼠結腸組織適量，加入裂解液勻漿處理，使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測上清液中蛋白濃度并制備蛋白樣品。取蛋白樣品20 μg，電泳、轉膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入MUC2、SCF、GAPDH、Tubulin抗體（稀釋比例分別為1∶2 000、1∶1 000、1∶3 000、1∶3 000），于4 ℃過夜；用TBST 緩沖液洗3 次，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（H+L）抗體（稀釋比例為1∶3 000），室溫孵育1 h；用ECL顯影，曝光并拍照保存。使用Image J 軟件進行分析，以MUC2 蛋白與內參蛋白Tubulin、SCF 蛋白與內參蛋白GAPDH 的灰度值比值分別計算MUC2和SCF蛋白的相對表達量。

2.9 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析。所有數據均用±s表示，若方差齊，采用單因素方差分析和SNK-q檢驗；若方差不齊，采用秩和檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 潤腸顆粒對便秘小鼠糞便含水量和腸道推進率的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠糞便質地堅硬干枯，糞便含水量和腸道推進率均顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，潤腸顆粒低、高劑量組和莫沙必利組小鼠糞便質地蓬松，糞便含水量和腸道推進率均顯著增加（P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組小鼠糞便含水量和腸道推進率的比較（±s，n＝6）

表2 各組小鼠糞便含水量和腸道推進率的比較（±s，n＝6）

a：與正常對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01。

組別正常對照組模型組潤腸顆粒低劑量組潤腸顆粒高劑量組莫沙必利組糞便含水量/%57.47±7.85 33.05±4.35a 55.81±7.56b 53.49±6.65b 52.03±4.50b腸道推進率/%72.99±10.18 35.26±7.23a 71.59±9.72b 73.30±8.74b 71.31±16.77b

3.2 潤腸顆粒對便秘小鼠結腸和回腸組織結構的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠結腸組織出現損傷，炎癥細胞明顯浸潤，杯狀細胞數量顯著減少，回腸絨毛結構出現斷裂。與模型組比較，潤腸顆粒低、高劑量組和莫沙必利組小鼠結腸組織損傷均減輕，炎癥細胞浸潤均減少，杯狀細胞數量均增加，回腸絨毛結構斷裂均明顯改善。結果見圖1、圖2（潤腸顆粒低劑量組圖略）。

圖1 各組小鼠結腸組織結構的顯微圖（HE染色）

圖2 各組小鼠回腸組織結構的顯微圖（HE染色）

3.3 潤腸顆粒對便秘小鼠結腸黏液分泌量的影響

正常對照組、模型組、潤腸顆粒低劑量組、潤腸顆粒高劑量組和莫沙必利組小鼠結腸黏液分泌量分別為0.10±0.01、0.04±0.02、0.07±0.01、0.09±0.01、0.06±0.01（n＝6）。與正常對照組比較，模型組小鼠結腸黏液分泌量顯著減少（P＜0.01）。與模型組比較，潤腸顆粒高劑量組小鼠結腸黏液分泌量顯著增加（P＜0.01）。結果見圖3（潤腸顆粒低劑量組圖略）。

圖3 各組小鼠結腸黏液的染色圖（阿爾新藍染色）

3.4 潤腸顆粒對便秘小鼠結腸組織中c-kit蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠結腸組織中c-kit蛋白表達水平降低。與模型組比較，潤腸顆粒低、高劑量組和莫沙必利組小鼠結腸組織中c-kit 蛋白表達水平均增加。結果見圖4（潤腸顆粒低劑量組圖略）。

圖4 各組小鼠結腸組織中c-kit 蛋白表達的免疫組化圖

3.5 潤腸顆粒對便秘小鼠結腸組織中炎癥因子mRNA表達的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠結腸組織中TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS mRNA 相對表達量均顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，潤腸顆粒低、高劑量組和莫沙必利組小鼠結腸組織中TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS mRNA相對表達量均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。結果見表3。

表3 各組小鼠結腸組織中炎癥因子mRNA 表達水平比較（±s，n＝6）

表3 各組小鼠結腸組織中炎癥因子mRNA 表達水平比較（±s，n＝6）

a：與正常對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01。

iNOS 1.00±0.28 3.65±0.91a 1.21±0.62c 1.05±0.27c 0.95±0.29c組別正常對照組模型組潤腸顆粒低劑量組潤腸顆粒高劑量組莫沙必利組TNF-α 1.00±0.38 3.90±1.56a 2.01±0.35b 1.53±0.27c 2.14±0.63c IL-6 1.00±0.60 5.38±3.09a 1.79±1.34b 1.79±0.80b 1.49±0.69c IL-1β 1.00±0.42 3.74±1.66a 0.61±0.17c 1.79±0.72b 1.68±0.54c

3.6 潤腸顆粒對便秘小鼠結腸組織中促進腸道運動相關因子mRNA表達的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠結腸組織中nNOS、smMLCK、5-HT4R、MUC2、SCF、c-kit mRNA相對表達量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，潤腸顆粒低、高劑量組和莫沙必利組小鼠結腸組織中nNOS（潤腸顆粒低劑量組除外）、smMLCK、5-HT4R、MUC2、SCF（潤腸顆粒低劑量組除外）、c-kit mRNA相對表達量均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表4。

表4 各組小鼠結腸組織中促進腸道運動相關因子mRNA表達水平比較（±s，n＝6）

表4 各組小鼠結腸組織中促進腸道運動相關因子mRNA表達水平比較（±s，n＝6）

a：與正常對照組比較，P＜0.01；b：與正常對照組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.05；d：與模型組比較，P＜0.01。

組別正常對照組模型組潤腸顆粒低劑量組潤腸顆粒高劑量組莫沙必利組nNOS 1.00±0.20 0.07±0.03a 0.71±0.36 0.90±0.33d 0.98±0.44d smMLCK 1.00±0.22 0.36±0.13a 0.91±0.27c 1.00±0.19c 1.03±0.14c 5-HT4R 1.00±0.23 0.12±0.09a 0.92±0.23d 1.05±0.23d 1.17±0.39d MUC2 1.00±0.29 0.43±0.17b 1.03±0.25c 1.06±0.37d 0.99±0.23c SCF 1.00±0.25 0.40±0.24b 0.80±0.10 1.06±0.29c 1.04±0.42c c-kit 1.00±0.31 0.16±0.08a 0.98±0.28d 1.23±0.34d 1.26±0.52d

3.7 潤腸顆粒對便秘小鼠結腸組織中MUC2和SCF蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠結腸組織中MUC2和SCF 蛋白相對表達量均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。與模型組比較，潤腸顆粒低、高劑量組和莫沙必利組小鼠結腸組織中MUC2 和SCF 蛋白相對表達量均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖5、圖6。

圖5 各組小鼠結腸組織中MUC2 和SCF 蛋白表達的電泳圖

圖6 各組小鼠結腸組織中MUC2 和SCF 蛋白表達水平檢測結果

4 討論

中醫認為腸道傳導失司和腸道失于濡潤都將導致便秘。洛哌丁胺是一類μ阿片受體激動劑，其能夠通過抑制腸道水分的分泌和結腸的蠕動，從而延長糞便排空時間，并延緩腸道的運輸[5]，已被廣泛用于誘導便秘模型。莫沙必利能夠改善胃腸動力，臨床上常用于治療便秘，本研究將其作為治療便秘的陽性對照藥[6]。本研究結果顯示，潤腸顆粒能改善便秘小鼠的糞便質地，提高糞便含水量和腸道推進率，且高劑量潤腸顆粒的作用與莫沙必利相似。這表明潤腸顆粒能夠促進小鼠糞便軟化和腸道蠕動，用于便秘小鼠的療效與莫沙必利相當。

結腸外黏液層內平坦的管腔表面能夠保護腸上皮細胞免受細菌侵害，抑制炎癥細胞浸潤，防止腸道發生感染[7]。本研究結果顯示，潤腸顆粒能夠減少小鼠結腸炎癥細胞的浸潤，降低炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS mRNA相對表達量。這表明潤腸顆粒可通過減輕便秘小鼠結腸炎癥，降低腸道通透性，而保護腸道屏障。結腸的黏液分泌是影響排便的重要因素。在腸黏膜中，MUC2是杯狀細胞分泌最多的黏液蛋白，其能夠使腸上皮細胞免受細菌攻擊，保護腸黏膜[8]。本研究結果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠結腸組織中MUC2 mRNA和蛋白表達均受到抑制，而潤腸顆粒可阻止這種抑制作用，能使MUC2的表達恢復到正常水平。這提示潤腸顆粒可能通過潤滑腸黏膜，減少腸道刺激和摩擦，而促進腸黏膜細胞產生更多的MUC2蛋白。

腸道傳輸收縮節律異常在便秘的發生機制中具有關鍵作用[9]。nNOS 缺陷的小鼠已被證明可表現出運動功能障礙和消化道功能、結腸功能紊亂[10]。smMLCK是控制平滑肌收縮起始的關鍵調節酶，降低腸道smMLCK活性，會導致以弱蠕動為特征的腸道運動障礙[11]。5-羥色胺是一類對腸道運動具有重要作用的神經遞質，其能參與消化道功能的調節，5-HT4R 能夠驅動腸道對5-羥色胺產生蠕動反應[12]。本研究結果顯示，潤腸顆粒能夠上調便秘小鼠結腸組織中nNOS、smMLCK、5-HT4R mRNA相對表達量，這表明潤腸顆粒可增強腸道運動功能。Cajal 間質細胞（interstitial cells of Cajal，ICC）作為胃腸道的起搏細胞，對于正常的腸道運動至關重要。SCF/c-kit信號傳導對ICC的發展具有重要作用[13]。本研究結果顯示，潤腸顆粒能夠上調便秘小鼠結腸組織中SCF 和c-kit mRNA 相對表達量。這提示潤腸顆粒改善便秘的作用機制可能是通過激活SCF/c-kit信號通路，增加ICC 的表達，來促進便秘小鼠腸道運動，改善腸道運動障礙。

綜上所述，潤腸顆粒具有潤腸通便的作用，能夠改善小鼠便秘，其潤腸機制可能與促進結腸黏液分泌和MUC2表達有關，其通便機制可能與激活SCF/c-kit信號通路有關。