納米銀對銅綠微囊藻生物毒性的電荷效應(yīng)

雍玲麗,陳猷鵬,郭勁松,方 芳,孫壯壯,晏 鵬(重慶大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院,重慶 400045)

近幾十年來,淡水藍(lán)藻有害藻華(CyanoHABs)在全球范圍內(nèi)顯著增加[1-2].大部分藍(lán)藻會產(chǎn)生藻毒素,危害水生生物和人類健康[3].水體環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)(氮、磷)、溫度、pH 值和鹽度對藍(lán)藻的增殖有顯著影響[4].目前,人類活動的加劇導(dǎo)致一些新興污染物進(jìn)入水生環(huán)境,如納米顆粒[5].一些研究報(bào)道,納米顆粒可以抑制藍(lán)藻的生長和增殖[6-8].但是,其抑制機(jī)制尚不清楚.銀納米顆粒(AgNPs)作為代表性納米顆粒,廣泛存在于水生環(huán)境中,據(jù)估計(jì),水環(huán)境中銀納米顆粒的濃度在納克/升到毫克/升之間[9].AgNPs 可引起細(xì)胞膜破壞、氧化損傷和蛋白質(zhì)變性,進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖.AgNPs 釋放的Ag+離子和內(nèi)化的AgNPs對藍(lán)藻細(xì)胞的生物毒性在以往的研究中已被廣泛報(bào)道[10-11].這些研究大多集中在AgNPs 的濃度、大小和形態(tài)對藍(lán)藻的毒性作用[12-14].AgNPs 的表面性質(zhì),如電位、親水性和表面官能團(tuán)等,尤其是表面電荷[15]也顯著地影響納米顆粒對微生物的生物毒性.研究表明,水環(huán)境中AgNPs 表面電荷以正電荷和負(fù)電荷兩種形式存在[16-17].AgNPs 表面電荷會影響其聚集性和吸附性,進(jìn)而影響顆粒的生物毒性[18-19].El Badawy等[20]研究發(fā)現(xiàn),帶負(fù)電荷的AgNPs和芽孢桿菌細(xì)胞之間存在高度排斥,形成了限制細(xì)胞-顆粒相互作用的靜電屏障.帶正電荷的AgNPs 與大腸桿菌間較大的電荷差造成了對大腸桿菌較高的毒性[15].遺憾的是,很少有研究關(guān)注AgNPs 對藍(lán)藻生物毒性的電荷效應(yīng),藍(lán)藻如何響應(yīng)和適應(yīng)不同表面電荷AgNPs 的生物脅迫尚不清楚.銅綠微囊藻(M.aeruginosa)是水生環(huán)境中最常見的有害藍(lán)藻之一.支鏈聚乙烯亞胺和檸檬酸鹽作為常用的納米顆粒的涂層/穩(wěn)定劑,能夠有效分散納米顆粒,在本研究中,這兩種涂層材料修飾的AgNPs 表面分別帶有穩(wěn)定的正電荷和負(fù)電荷.本研究通過研究不同表面電荷的AgNPs 對銅綠微囊藻生長狀態(tài)、生理代謝特性和微觀結(jié)構(gòu)的影響,以期揭示AgNPs 對銅綠微囊藻生物毒性的電荷效應(yīng).研究結(jié)果將為AgNPs 對藍(lán)藻銅綠微囊藻的生物毒性提供參考.

1 材料與方法

1.1 表征及暴露實(shí)驗(yàn)

支鏈聚乙烯亞胺包覆的AgNPs(BPEI-AgNPs,(15.23±2.17)mV)和檸檬酸鹽包覆的 AgNPs(Citrate-AgNPs,(?14.36±4.21)mV)由北京德科納米科技有限公司生產(chǎn).兩種AgNPs 的平均粒徑為50nm,均具有光滑的球形外觀和均勻的粒徑分布.

銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa,FACHB-132)來源于中國科學(xué)院武漢水生生物研究所(中國武漢).將處于指數(shù)生長期的銅綠微囊藻接入盛有新鮮BG1-11 培養(yǎng)基的500mL 無菌錐形燒瓶中(初始藻密度約為1.5×106cells/mL),再分別加入新鮮制備的NPs 母液(經(jīng)600W 超聲處理30min 后使用),使錐形燒瓶中NPs 最終暴露濃度分別為0(對照),0.05,0.2和0.5mg/L.每組設(shè)3 個(gè)平行試驗(yàn)組,培養(yǎng)周期為16d,實(shí)驗(yàn)過程培養(yǎng)條件為:25°C,光照強(qiáng)度4000lx,光暗比12h:12h.本研究中所選取的AgNPs 暴露濃度是既考慮了實(shí)際環(huán)境濃度范圍,同時(shí)結(jié)合了先前研究所選擇的濃度條件[21-23].整個(gè)給藥過程在無菌操作臺下進(jìn)行.

1.2 生理代謝特性分析

通過測量藻液在680nm 波長處的OD 值(OD680)來測定藻細(xì)胞密度.采用流式細(xì)胞儀(FACSVantageSE,BD,美國)檢測藻細(xì)胞凋亡情況.利用多脈沖調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(Phyto-PAM,Walz,Effeltrich,德國)計(jì)算和測量光合反應(yīng)過程中光系統(tǒng)(PSII)過程的最大光能轉(zhuǎn)換效率(Fv/Fm)和最大相對電子轉(zhuǎn)移速率rETRmax.

將藻細(xì)胞經(jīng)超聲波細(xì)胞破碎儀(JY 92-IIN,650W,4s-4s)冰浴破碎5min 后用丙二醛檢測試劑盒(A003-1-2,南京建成生物工程研究所,中國)測定樣品中丙二醛含量.

藻細(xì)胞胞外聚合物(EPS)通過熱提法提取,利用硫酸-蒽酮法測定EPS 中多糖的含量,EPS 中的蛋白用蛋白含量測定試劑盒(P930077-100T/EA,上海麥克林生化科技有限公司,中國),最后用酶標(biāo)儀測定562nm 處吸光度并計(jì)算蛋白含量.多糖和蛋白的總和為EPS 含量.

用10kDa 過濾器(Millipore,德國)和電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP-OES,Thermo,Bremen,德國)提取并測定AgNPs 在培養(yǎng)液中釋放的Ag+離子含量,胞內(nèi)Ag+離子含量測定需先對藻液樣品進(jìn)行前處理,包括藻液離心、清洗藻泥、超聲破碎后再離心10min,得上清液進(jìn)行測定.

利用掃描電子顯微鏡(DM 2000,LEICA,Wetzlar,德國)和透射電子顯微鏡(JEM-2100,JEOL,Tokyo,日本)觀察藻類細(xì)胞表面微觀形貌和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化[24].

1.3 RNA 提取和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

根據(jù)制造商的說明(Invitrogen,Carlsbad,CA,美國),使用Trizol 試劑從銅綠微囊藻樣品中提取總RNA,分別使用 Agilent Bioananlyzer 2100(Santa Clara,CA,美國)和Nano Photometer?分光光度計(jì)(IMPLEN,CA,美國)對總RNA 的完整性和純度進(jìn)行檢測.之后利用Illumina平臺生成的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析.所有分析均使用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司云平臺(cloud.majorbio.com)進(jìn)行,使用edgeR、DESeq2 和DESeq 軟件進(jìn)行基因差異表達(dá)分析.

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果的測定重復(fù)3 次,然后使用IBM SPSS Statistics 26 軟件進(jìn)行顯著性分析,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以P<0.05 為顯著性差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 對銅綠微囊藻生長和光合活性的影響

藻細(xì)胞密度是反映藻細(xì)胞生長情況的基本指標(biāo)之一.對照組銅綠微囊藻細(xì)胞密度逐漸增大,而AgNP組細(xì)胞密度先增大后減小(圖1A 和1B).此外,3 種濃度下的BPEI-AgNPs 在第2d 均對銅綠微囊藻生長呈現(xiàn)顯著抑制(P<0.05),而3 種濃度的Citrate-AgNPs 在第6d 均顯著抑制藻細(xì)胞生長(P<0.05).6d 后,Citrate-AgNP組銅綠微囊藻生長抑制率大于BPEI-AgNP組.這表明BPEI-AgNPs 在早期對銅綠微囊藻的生長有較強(qiáng)的抑制作用,而Citrate-AgNPs 在后期的抑制作用更大.與相同濃度的BPEI-AgNPs 相比,0.05,0.2 和0.5mg/L Citrate-AgNPs 對藻細(xì)胞生物量的最大抑制率分別高48.73%,83.57%和96.8%,說明帶負(fù)電荷的AgNPs 對銅綠微囊藻的生長抑制作用比帶正電荷的AgNPs 更強(qiáng).

圖1 AgNPs 對銅綠微囊藻藻密度和光合作用參數(shù)的影響Fig.1 Effects of AgNPs on algal density and photosynthetic parameters of M.aeruginosa

Fv/Fm是最大光化學(xué)效率,rETRmax通常用來表征光合作用的最大電子傳遞速率,兩者都是表征藻類細(xì)胞光合系統(tǒng)II活性的常用指標(biāo)[25].AgNP處理組的Fv/Fm低于對照組,說明銅綠微囊藻的光合活性受到抑制(圖1C).BPEI-AgNPs 在前期對光合系統(tǒng)II 抑制作用更強(qiáng),而Citrate-AgNPs 在后期抑制作用更為顯著.此外,對于Fv/Fm的最大抑制率,0.05,0.2 和0.5mg/LCitrate-AgNP 組分別比同濃度BPEI-AgNP 組高17.72%,22.2%和34.24%.同時(shí)0.05,0.2 和0.5mg/L BPEI-AgNP 組的rETRmax峰值分別為12.05,13.20 和9.72μmol/(m2·s),Citrate-AgNP 組的rETRmax峰值分別為11.90,10.06和8.25μmol/(m2·s)(圖1D),這表明銅綠微囊藻暴露于帶負(fù)電荷的AgNPs 下具有較低的能量代謝活性.

2.2 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 對銅綠微囊藻的氧化損傷

丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,可以指示細(xì)胞被AgNPs 氧化損傷的程度[26].暴露于兩種AgNPs 后,銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)MDA 含量均高于對照組(圖2A 和2B),說明AgNPs 的加入導(dǎo)致銅綠微囊藻細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化,破壞膜的流動性、通透性和細(xì)胞膜的完整性[11].隨著暴露時(shí)間延長,BPEIAgNP 處理組MDA 含量先升高后穩(wěn)定,Citrate-AgNP 處理組MDA 含量一直升高.此外,各濃度Citrate-AgNP 組的 MDA 峰值含量最終均高于BPEI-AgNP 組,其中,0.5mg/L Citrate-AgNP 組的丙二醛(MDA)含量峰值(100.8nmol/mgprot))是同濃度BPEI-AgNP 組(82.5nmol/mgprot)的1.22 倍.這說明Citrate-AgNPs 造成了更大的氧化損傷.

圖2 AgNPs 暴露下銅綠微囊藻的MDA,EPS 和胞內(nèi)外Ag+含量變化情況Fig.2 The changes in MDA,EPS,and intracellular and extracellular Ag+ content in M.aeruginosa under AgNPs exposure

胞外聚合物(EPS)常被用作藻細(xì)胞抵抗環(huán)境脅迫的方式之一,其含量可間接指示藻細(xì)胞所受脅迫的程度.暴露于這兩種AgNPs 的銅綠微囊藻細(xì)胞分泌明顯更多的EPS(P<0.05),且EPS 含量與AgNPs濃度基本呈正相關(guān)(圖2C),這表明BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 都會引起銅綠微囊藻的應(yīng)激反應(yīng)且應(yīng)激反應(yīng)程度具有劑量效應(yīng).于朋飛等[27]也發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻細(xì)胞可分泌胞外物質(zhì)吸附細(xì)胞附近的AgNPs 顆粒.銅綠微囊藻在BPEI-AgNPs 作用下分泌的EPS 含量大于Citrate-AgNPs 作用下分泌的EPS 含量,第16d,0.5mg/L BPEI-AgNP 組的EPS 含量(32.21mg/gSS)是同濃度Citrate-AgNP 組(4.42mg/gSS)的7.29 倍.這說明銅綠微囊藻對BPEI-AgNPs更為敏感,分泌大量EPS 以減輕BPEI-AgNPs 的毒性.因此,銅綠微囊藻對帶正電荷的AgNPs 具有更強(qiáng)的耐受性,BPEI-AgNPs對銅綠微囊藻的生長抑制和細(xì)胞生理代謝損傷較低.

為進(jìn)一步揭示不同表面電荷AgNPs 對銅綠微囊藻的影響,測定了0.5mg/L AgNP 處理組胞內(nèi)外Ag+的釋放情況(圖2D).兩種AgNP 組中,胞內(nèi)外Ag+含量隨暴露時(shí)間的增加而增加.此外,BPEI-AgNP 組胞內(nèi)外Ag+含量在早期均較高,而Citrate-AgNP 組在后期均顯著升高.最終Citrate-AgNP 組胞內(nèi)外Ag+含量分別為BPEI-AgNP 組的2.13 倍和1.63倍.Ag+含量的變化與銅綠微囊藻中MDA 含量和細(xì)胞損傷的變化一致,表明Ag+的釋放量在不同電荷下AgNPs 的毒性中起重要作用.

2.3 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 對銅綠微囊藻細(xì)胞形態(tài)的影響

通過SEM 觀察0.5mg/L 不同電荷AgNPs 作用下銅綠微囊藻的表面形貌,結(jié)果如圖3所示.BPEIAgNPs 聚集在銅綠微囊藻細(xì)胞表面(第4d)(圖3A),然而,未觀察到Citrate-AgNPs 吸附在銅綠微囊藻的表面,細(xì)胞表面也無明顯變化(第4d)(圖3B).這表明BPEI-AgNPs 可因靜電引力而吸附在帶負(fù)電荷的銅綠微囊藻細(xì)胞表面,進(jìn)而可能導(dǎo)致掩蔽效應(yīng)[28-29],使得早期BPEI-AgNPs 嚴(yán)重抑制了銅綠微囊藻對光能的吸收和利用.16d 后,暴露于BPEIAgNPs 的銅綠微囊藻細(xì)胞表面出現(xiàn)大量EPS,其中包裹著BPEI-AgNPs(圖3C),說明BPEI-AgNPs 刺激銅綠微囊藻分泌大量EPS,進(jìn)而減輕了BPEIAgNPs 的毒性.暴露于Citrate-AgNPs16d 后,細(xì)胞表面皺縮、碎裂,細(xì)胞形態(tài)不完整(圖3D),這可能與處理后期 Citrate-AgNPs 引起的強(qiáng)烈的氧化損傷(MDA 含量激增)有關(guān).透射電鏡也得到了類似的結(jié)果(圖3E 和3F).同時(shí)在藻細(xì)胞內(nèi)部觀察到少量BPEI-AgNP,但未觀察到有Citrate-AgNPs 存在.此外,暴露于Citrate-AgNPs 后,銅綠微囊藻細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的損傷(圖3E 和3F),這與Citrate-AgNPs 作用后期大量Ag+釋放到細(xì)胞中有關(guān),大量Ag+進(jìn)入銅綠微囊藻細(xì)胞后可能干擾酶活性中心,刺激了ROS 的產(chǎn)生[30],造成了比BPEI-AgNPs 更嚴(yán)重的細(xì)胞損傷.

圖3 AgNPs 暴露下銅綠微囊藻的掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)圖像Fig.3 Scanning electron microscope(SEM)and transmission electron microscope(TEM)images of M.aeruginosa under AgNPs exposure

2.4 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 對銅綠微囊藻細(xì)胞凋亡的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測兩種AgNPs 對銅綠微囊藻細(xì)胞凋亡的影響.Q3-UL、Q3-UR、Q3-LR 和Q3-LL 分別代表壞死區(qū)、晚凋區(qū)、早凋區(qū)和活菌區(qū).對照組存活細(xì)胞比例從第 0d(96.84%)到第 16d(96.15%)基本保持不變,對照組壞死、早凋和晚凋區(qū)細(xì)胞比例均小于3%,從第0～16d 無明顯變化(圖4A和4B).16d 時(shí),AgNP 處理組活細(xì)胞比例低于對照組,壞死和早凋細(xì)胞比例高于對照組.0.05,0.2 和0.5mg/LCitrate-AgNP 處理組的活細(xì)胞比例分別比BPEIAgNP 處理組低2.79%,16.14%和20.79%(16d).各濃度水平下,Citrate-AgNP 處理組的壞死細(xì)胞和早凋細(xì)胞比例均高BPEI-AgNP 處理組,說明在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi),Citrate-AgNPs 對銅綠微囊藻細(xì)胞的損傷更大,這與生物量的變化趨勢一致.

圖4 AgNPs 對銅綠微囊藻細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effects of AgNPs on apoptosis of M.aeruginosa cells

2.5 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 暴露下銅綠微囊藻的轉(zhuǎn)錄組

GO 富集分析結(jié)果顯示,BPEI-AgNPs 對銅綠微囊藻的影響主要涉及能量代謝、光合作用和胞外聚合物相關(guān)途徑(圖5A 和5B).其中,鐵硫簇結(jié)合途徑基因顯著富集(FDR=0.045),說明BPEI-AgNPs 顯著抑制了銅綠微囊藻光合作用和呼吸作用中的相關(guān)電子傳遞過程.此外,胞外聚合物代謝相關(guān)的糖胺聚糖代謝基因和肽聚糖代謝基因表達(dá)顯著上調(diào),這可能是藻細(xì)胞減輕BPEI-AgNPs 毒性的機(jī)制之一.Citrate-AgNP 組差異基因的GO 富集分析結(jié)果如圖5C 和5D所示.光合色素合成和含卟啉化合物代謝相關(guān)基因表達(dá)量顯著下調(diào)(FDR<0.01),表明Citrate-AgNPs 干擾了銅綠微囊藻對光能的吸收利用.同時(shí),呼吸通路相關(guān)基因表達(dá)量顯著下調(diào)(FDR<0.01),能量代謝受到Citrate-AgNPs 的嚴(yán)重影響.值得注意的是,與離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性相關(guān)的基因表達(dá)顯著上調(diào)(FDR=0.037).因此,后期大量Ag+進(jìn)入銅綠微囊藻細(xì)胞,刺激SOD 活性增強(qiáng)以降低活性氧水平.

圖5 AgNPs 暴露下銅綠微囊藻差異基因GO 富集分析及KEGG 富集分析熱圖Fig.5 Heat maps of differential gene GO enrichment and KEGG enrichment in M.aeruginosa exposed to AgNPs

2.6 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 暴露下銅綠微囊藻的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.6.1 與光合作用和能量代謝相關(guān)的調(diào)控途徑 在BPEI-AgNP 和Citrate-AgNP 組中,分別有14個(gè)和15 個(gè)與卟啉和葉綠素代謝相關(guān)的基因下調(diào)(圖5E 和5F).rbcS 和rbcL 編碼了參與光合碳固定生成3-磷酸-D-甘油(PGA)的羧化過程[31-32].銅綠微囊藻中rbcS 的表達(dá)量在BPEI-AgNP(Log2FC=-1.04)和Citrate-AgNP(Log2FC=-1.12)組中顯著下調(diào),rbcL 的表達(dá)量在 BPEI-AgNP(Log2FC=-2.04)和 Citrate-AgNP(Log2FC=-2.16)組顯著下調(diào)(圖6).同時(shí),fbp、tktA 和prk 負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)產(chǎn)生β-D-果糖6-磷酸(F6P)、D-酮糖-5-磷酸(RP)和核糖1,5-二磷酸(RuBP)的酶促反應(yīng),在Citrate-AgNP 組中,它們的下調(diào)幅度更大.por涉及調(diào)節(jié)丙酮酸(PYR)轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A過程,BPEI-AgNP(Log2FC=-2.31)和Citrate-AgNP(Log2FC=-2.75)組por 的表達(dá)水平均下調(diào),Citrate-AgNP 組下調(diào)水平更高.在兩種AgNPs 脅迫下,cs 和pckA 表達(dá)水平分別上調(diào)和下調(diào),草酰乙酸(OAA)濃度升高,從而向檸檬酸(CIT)轉(zhuǎn)化效率提高,這可能是銅綠微囊藻細(xì)胞應(yīng)對兩種AgNPs 脅迫相同的補(bǔ)償策略之一.此外,BPEI-AgNP 組有其他補(bǔ)償方式:提高了pyk 的基因表達(dá)水平,增加了將磷酸烯醇丙酮酸(PEP)轉(zhuǎn)化為PYR的酶的表達(dá),促進(jìn)了PYR的合成.以上結(jié)果說明BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 抑制光捕獲和能量轉(zhuǎn)換,同時(shí)Citrate-AgNPs 的抑制率較高,可能與大量Ag+的侵入有關(guān),最終導(dǎo)致銅綠微囊藻的生長受到明顯抑制.

圖6 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 暴露下銅綠微囊藻光合作用、能量代謝和氧化應(yīng)激途徑的KEGG 分析Fig.6 KEGG analysis of photosynthesis,energy metabolism and oxidative stress pathways in M.aeruginosa exposed to BPEI-AgNPs and Citrate-AgNPs

2.6.2 與氧化應(yīng)激相關(guān)的調(diào)控途徑 暴露于兩種AgNPs 時(shí),sod2 表達(dá)上調(diào),且Citrate-AgNP 組上調(diào)幅度(log2FC=1.33)高于 BPEI-AgNP 組(log2FC=1.03)(圖6),說明兩種AgNPs 均刺激了銅綠微囊藻中SOD 酶的轉(zhuǎn)錄,Citrate-AgNP 組轉(zhuǎn)錄更多.而GPX 參與了過氧化氫轉(zhuǎn)化為分子水的過程,其表達(dá)量在BPEI-AgNP 和 Citrate-AgNP 組中均表現(xiàn)為下調(diào).sod2 基因的上調(diào)和GPX 基因的下調(diào)導(dǎo)致藻類細(xì)胞中過氧化水平升高.結(jié)合第16d BPEI-AgNP 組和Citrate-AgNP 組MDA 水平的激增,我們推測暴露于兩種AgNPs 的銅綠微囊藻細(xì)胞受到了嚴(yán)重的氧化損傷,且Citrate-AgNP 組藻細(xì)胞損傷程度更大.

2.6.3 與細(xì)胞外聚合物合成相關(guān)的調(diào)控途徑 纈氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)和亮氨酸(Leu)等氨基酸是細(xì)胞外蛋白(PN)的主要前體.pdhA、pdhB 和aceF 的表達(dá)調(diào)節(jié)了PEP 向Val和Leu 的轉(zhuǎn)化,它們在BPEI-AgNP 組的表達(dá)量均顯著上調(diào)(Log2FC>1)(圖7).相比之下,暴露于Citrate-AgNPs 后,銅綠微囊藻中 pdhB 的表達(dá)量上調(diào)(Log2FC=1.27),然而pdhA 和aceF 的表達(dá)量均有下調(diào).尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDPGlcNAc)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)和甘露糖6-磷酸(Man-6P)是胞外多糖的重要前體,其中g(shù)lmM 和glmU 參與調(diào)節(jié)葡萄糖胺6-磷酸(GlcN-6P)向UDP-GlcNAc 的轉(zhuǎn)化.兩種AgNPs 均刺激glmM和glmU的表達(dá),且BPEI-AgNP組上調(diào)幅度更大.ugd參與尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)向UDP-GlcA 的轉(zhuǎn)化,BPEI-AgNP 組(Log2FC=0.67)的ugd 表達(dá)上調(diào)幅度高于Citrate-AgNP 組(Log2FC=0.58).此外,編碼Man-6P 合成的 manA 表達(dá)在 BPEI-AgNP 組(Log2FC=1.13)中表現(xiàn)為上調(diào),而在Citrate-AgNP 組(Log2FC=-1.15)中為下調(diào).

圖7 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 暴露下銅綠微囊藻氨基酸和氨基糖途徑的KEGG 分析Fig.7 KEGG analysis of amino acid and amino sugar pathways in M.aeruginosa exposed to BPEI-AgNPs and Citrate-AgNPs

與Citrate-AgNPs 相比,BPEI-AgNPs 顯著促進(jìn)了PN 和PS 前體的合成,說明銅綠微囊藻分泌EPS包裹BPEI-AgNPs并中和其毒性,而在Citrate-AgNP組中EPS 分泌不足,因此Citrate-AgNPs 對藻細(xì)胞的生長抑制和氧化損傷程度均大于BPEI-AgNPs.

本研究有效揭示了不同表面電荷AgNPs 對銅綠微囊藻的生物毒性效應(yīng),為探究銀納米顆粒潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)以及藍(lán)藻水華的防治策略提供了理論支撐.

3 結(jié)論

3.1 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 均通過抑制光合作用和能量代謝來抑制銅綠微囊藻的生長,并且破壞細(xì)胞膜.

3.2 銅綠微囊藻對 Citrate-AgNPs 的耐受性較差.BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 都干擾了銅綠微囊藻光合電子傳遞和光合色素合成代謝,阻礙了能量轉(zhuǎn)換.

3.3 BPEI-AgNPs 易吸附于銅綠微囊藻細(xì)胞表面,因而刺激其分泌大量EPS,從而中和了BPEI-AgNPs的毒性.Citrate-AgNP 組中大量Ag+的存在激活了活性離子進(jìn)入藻細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)過程,導(dǎo)致ROS 水平上升,對藻細(xì)胞的損傷更為顯著.