17α-乙炔雌二醇脅迫下零價鐵對硝化污泥中抗性基因的影響

王麗麗 ,李安婕 ,張傳國 (.交通運輸部天津水運工程科學研究院水路交通環境保護技術交通行業重點實驗室,天津300456；2.北京師范大學環境學院,水沙科學教育部重點實驗室,水環境模擬國家重點實驗室,北京 00875)

近年來,抗生素抗性基因(ARGs)污染正成為對全球生態環境安全和人體健康領域的的巨大威脅,同時,人工合成雌激素乙炔基雌二醇(EE2)因其內分泌干擾性強及生態風險大等特點而受到了廣泛關注.活性污泥作為污水處理廠中典型生物處理工藝是多種、豐富ARGs 的儲存庫和排放源[1].具有硝化能力的活性污泥,硝化污泥可有效去除抗生素、雌激素類新污染物[2-3],已有文獻研究表明三氯卡班、磺胺甲惡唑等新污染物可增加硝化污泥中的ARGs 豐度[4-5].然而目前研究大多集中在提高硝化污泥工藝去除EE2 的效率方面,有關EE2 對硝化污泥中的ARGs 的影響鮮有報道.

零價鐵(ZVI)作為新興的低成本、綠色環保材料,已廣泛應用于污水處理領域.已有研究表明ZVI 不僅可提高生物處理工藝去除污水中常見污染物(如C、N、S、P 元素)的效率[6],也可增強硝化污泥中雌激素EE2 等藥品類新污染物的礦化程度和去除效果[7].同時ZVI 被報道可以減少剩余污泥厭氧消化產生的ARGs 豐度[8],然而ZVI 對硝化污泥中ARGs的影響尚未明確.值得注意的是,某些ARGs 即使在豐度水平很低的情況下,也可能對人類健康具有較大的威脅[9-10],因此在考察EE2及ZVI對硝化污泥中ARGs 的影響時,除豐度外也需要考慮ARGs 的抗性風險問題.

本研究借助宏基因組測序技術考察ZVI對硝化污泥處理EE2 過程中ARGs 的影響,評估EE2 及ZVI作用下硝化污泥中的ARGs 抗性風險,探究菌群結構與ARGs之間的相關性,以期為ZVI削減生物脫氮工藝處理藥品類新污染物過程中ARGs 豐度,控制ARGs 抗性風險提供科學依據與理論指導.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

硝化污泥接種自實驗室一短程硝化顆粒污泥序批式反應器(SBR).ZVI 顆粒純度大于99%,直徑為1mm,BET 比表面積為0.05m2/g.EE2(純度>98%)購于Dr.Ehrenstorfer 公司(德國).其余試劑均為優級純,購自中國國藥集團化學試劑有限公司.

1.2 序批式反應器運行

將初始污泥濃度(MLSS)為4.5g/L 的硝化污泥接種到兩個柱狀有機玻璃SBR(高42cm,直徑為3.3cm,工作體積為0.36L).SBR 底部進水,中部出水,交換比為50%,底部曝氣,曝氣流量用流量計控制在0.125L/min.每個運行周期共4h,時間分配為:進水5min,曝氣225min,污泥沉淀5min,最后出水5min.反應器中水溫保持在20℃左右.SBR 進水為人工配制,包括NH4Cl(320mg N/L)、EE2(10μg/L)、營養物質、微量元素和 NaHCO3.營養物質和微量元素參考Wang 等[2]人研究,NaHCO3的添加量依據出水pH 值進行調整,以維持出水pH 值在中性至堿性范圍內.為探究環境濃度的EE2 對硝化污泥中抗性基因的影響,本研究將EE2 濃度設置在μg/L 水平.參考Xu等[11]人研究,將其中一SBR 中加入30g/L 的ZVI,命名為EE2+ZVI 組,另一SBR 命名為EE2 組,ZVI 投加濃度參考自Yang 等[12]人研究.反應器運行共240個循環.

1.3 宏基因組測序及生物信息學分析

采用宏基因組測序技術對EE2及ZVI暴露下硝化污泥中ARGs 豐度及菌群結構變化進行探究.接種污泥和SBR 實驗結束時兩反應器中污泥樣品用0.01mol/L PBS 清洗3 次后,使用E.Z.N.A.Soil DNA Kit 試劑盒(美國OmegaBio-tek)對樣品DNA 進行抽提,隨后檢測DNA 濃度、純度和完整性.使用Covaris M220 超聲破碎儀(基因有限公司)將DNA片段化,用于后續構建文庫,使用NEXTflex Rapid DNA 建庫試劑盒(美國Bioo Scientific)進行建庫,隨后在Illumina NovaSeq 測序平臺進行測序,原始數據已上傳至 NCBI 數據庫(BioProject ID PRJNA871801).

對測序數據進行質控,使用拼接軟件MEGAHIT 軟件對質控后的序列進行拼接組裝.在拼接結果中篩選大于等于300bp 的Contigs 作為最終的組裝結果.使用Prodigal 軟件對拼接結果中的Contigs 進行開放閱讀框預測,選擇其中長度大于等于100bp 的基因序列.通過CD-HIT 軟件對本研究中樣品預測出的基因序列按照序列相似度、覆蓋度大于等于90%的原則進行聚類,構建非冗余基因組集.使用SOAPaligner 軟件,將3 組樣品中的高質量序列與上述非冗余基因集按照95%相似性進行對比.按照TPM(transcripts per million)計算方法統計基因在對應樣品中的豐度信息[7],即以該基因通過基因長度標準化后的基因豐度在該樣本中所有基因長度標準化后的基因豐度總和中占比的百萬倍來表示.通過 Diamond 軟件將基因集與 CARD 數據庫(Comprehensive Antibiotic Resistance Database)、NR數據庫(Non-Redundant Protein Sequence Database)及KEGG 數據庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)對比,對比類型BLASTP,e-value 參數設置為1×10-5,以獲得樣品中的抗性功能、物種分類和KEGG 功能注釋信息.

1.4 數據分析及繪圖

使用OriginPro 2022 或R 4.3.0 軟件進行數據處理及繪圖.

2 結果與討論

2.1 EE2 及ZVI 對硝化污泥ARGs 豐度的影響

接種污泥、EE2 組及EE2+ZVI 組,3 組樣品中的ARGs 豐度如表1所示,接種污泥、EE2 組及EE2+ZVI 組在抗性機制水平上的ARGs 總豐度分別是38232.82,38957.24 及37052.06TPM,EE2 的加入使污泥中的ARGs 豐度提高了724.42TPM,而ZVI 降低了該趨勢.此外,KEGG 功能注釋結果表明,ZVI 使得信號傳導(Signal transduction)通路的豐度降低(接種污泥、EE2 組及 EE2+ZVI 組中豐度分別為28213.07,28518.34 及26686.60TPM),有研究發現信號傳導通路的增強驅動了剩余污泥中ARGs 的傳播[13],這說明ZVI 在控制硝化污泥中ARGs 的傳播方面具有潛力;雙組分系統(Two-component system)是細菌中常見的調節機制,細菌可以通過此系統感知一系列刺激并作出適當的適應性反應,在以往研究中,該系統通路的富集與細菌對抗生素的抗性有關[14],EE2+ZVI 組中該通路豐度(20875.44TPM)低于接種污泥(22455.70TPM)及EE2組(22807.10TPM),上述KEGG 功能注釋結果與前文中ZVI 削減了硝化污泥處理EE2過程中ARGs的現象一致.nm或μm尺寸的ZVI 被報道可通過降低ARGs 宿主細菌的豐度而減少雞糞、牛糞或剩余污泥厭氧處理過程中的ARGs 豐度[8,15-16],因此可結合菌群結構變化進一步探究本研究中ZVI 降低硝化污泥中ARGs 的機理.

表1 各抗性機制ARGs 豐度(TPM)Table 1 ARGs abundance for resistance mechanism(TPM)

硝化污泥中抗性機制共有6 種(表1),其中抗生素外排泵是3 組樣品中最主要的抗性機制,其次為抗生素靶點改變和抗生素靶點保護.研究表明,外排泵在細菌中廣泛存在,在介導細菌多重耐藥中起著重要作用[17],抑制外排系統中外排泵蛋白的表達量可以降低細菌對藥物的外排作用,減緩耐藥性的產生.本研究中豐度前10的ARGs包括macB、tetA(58)、novA、mtrA、bcrA、oleC、patA、evgA 及evgS,均屬于外排泵機制,涉及大環內酯類、四環素類、氨基香豆素、青霉烷、肽類及氟喹諾酮類等抗生素.

2.2 EE2 及ZVI 對硝化污泥中ARGs 類型及組成的影響

3 組樣品中均包含20 種ARGs 類型(ARG type,圖1),其中多重耐藥(Multidrug)為主要抗性類型,其次為大環內酯-林可酰胺-鏈霉菌素(MLS)及糖肽類(Glycopeptide).EE2加入后上述類型的ARGs的豐度分別增加了267.27,274.50 和189.34TPM.而ZVI 減弱了上述ARGs 的豐度在EE2 作用下增強的趨勢,豐度相比EE2 組污泥分別降低了476.20,221.72 和365.52TPM.有研究表明EE2 暴露有利于硝化污泥中對不同類別的抗生素均具有抗藥性的細菌的生長,如Comamonas[2,18],這說明盡管EE2 并非抗生素類物質,但可能通過影響菌群結構而間接影響硝化污泥中ARGs 豐度.因此,如前文所述,上述現象或可與菌群結構聯合分析,以明確相應機制.接種污泥中有502 個ARGs 亞型(ARGs subtype),特有亞型為8個,EE2 組和EE2+ZVI 組分別有496 和499 個亞型,特有亞型均為3 個,說明EE2 及ZVI 對硝化污泥中ARGs 亞型種類影響較小.

圖1 ARG 類型水平上的ARGs 豐度Fig.1 ARGs abundance at ARG type level

將ARGs 亞型水平上的ARGs 豐度(前50)進行樣品間Z 分數標準化聚類分析,結果顯示EE2 和ZVI 的添加改變了硝化污泥中ARGs 亞型的分布.三組樣品分為了兩大類,一類為接種污泥,一類為EE2 組和EE2+ZVI 組,后者的共同點是添加了EE2,兩類通過有無EE2 區分,這說明EE2 的影響大于ZVI 的影響(圖2).ZVI 增加了硝化污泥中mexQ、tetW、kdpE、baeR 和PmpM 的豐度,涉及多重耐藥、四環素類、氨基糖苷類這3 種ARGs 類型.EE2 增加了硝化污泥中的evgA、efrB、lsaC、mtrA、smeD、efrA、patB、AcrS、tetM、ANT(3’’)-IIa、baeS 和OprM 的豐度,涉及多重耐藥、氟喹諾酮類、四環素類、氨基糖苷類這4 種ARGs 類型,而ZVI 降低了上述ARGs 的豐度.

圖2 ARG 亞型水平上的ARGs 豐度Fig.2 ARGs abundance at ARG subtype level Z 分數標準化后

2.3 EE2 及ZVI 對硝化污泥中抗性風險的影響評估

為減輕全球目前普遍存在的抗生素耐藥性危機,除了ARGs 的豐度和類型外,還迫切需要全面了解ARGs 在污水處理單元中的健康風險.Zhang等[9]在2022年創建了一個對ARGs 的健康風險進行評估的數據庫,該數據庫根據2561 種ARGs 亞型的人類可及性、可移動性、致病性和臨床可用性,對其進行了風險排序,共分為4 個級別,其中Q1風險最高,其次為Q2、Q3、Q4.本研究依據該數據庫對3 組硝化污泥中的ARGs 抗性風險進行了評估(圖3),可以發現EE2 組中落在高風險等級Q1和 Q2 的豐度有所提高,分別提高了 555.75 及151.08TPM,而添加ZVI 組相比硝化污泥和EE2 組中各等級的豐度均有減少,相比接種污泥減少了1004.87TPM,相比EE2 組減少了1459.63TPM,上述結果說明EE2 可能增加了硝化污泥中的ARGs抗性風險,而ZVI 減少了抗性風險.多重耐藥是硝化污泥中豐度占比最大的高風險(Q1 和Q2 等級)ARGs 類型,占比49.23%,因此硝化污泥中多重耐藥ARGs 需被重視.

圖3 ARGs 抗性風險評估Fig.3 ARGs resistance risk assessment

2.4 硝化污泥中ARGs 與細菌群落間的相關性

攜帶不同ARGs 的細菌可能在不同環境條件下增多或減少,從而改變ARGs 的分布[19].本研究分析了3 組硝化污泥樣品中的群落結構,分別檢測到11個門水平和144 個屬水平的細菌,圖4 展示了豐度占比≥1%的門和屬.在門水平,變形菌門(Proteobacteria)是本研究中硝化污泥細菌菌群結構的主要組成部分(圖4a),在細菌群落總豐度中占比為71.86%(接種污泥)、76.48%(EE2 組)及 70.21%(EE2+ZVI組).Saunders 等[20]的研究表明在污水處理廠的活性污泥微生物種群中 Proteobacteria 占據核心地位,Proteobacteria 被報道可參與碳氫化合物、酚類的生物降解[21-22].在EE2 暴露下的240 個循環后,Proteobacteria 的相對豐度增加了4.62%,這可能是由于 EE2 促進了某些可降解復雜有機污染物的Proteobacteria 門細菌生長,與前人的研究一致[2].而ZVI 及EE2 聯合作用下其豐度并未增加,說明ZVI并不能促進Proteobacteria 生長.Proteobacteria 門細菌被報道可驅動生物體系中ARGs 水平[23],因此可推測本研究中EE2 促進了Proteobacteria 門細菌生長,進而增加了硝化污泥中ARGs 豐度,而ZVI 表現出了對Proteobacteria 的抑制,減少了EE2 脅迫作用下ARGs 豐度增長的趨勢.

圖4 門水平(a)和屬水平(b)上的微生物組成Fig.4 Microbial composition at phylum level(a)and genus level(b)

基于皮爾森相關性分析ARGs 與微生物群落之間的關系(圖5),結果表明豐度前20 的ARGs 均與豐度前20 的菌屬有不同程度的相關性.研究結果表明豐度前20 的微生物菌屬中有10 種菌屬與ARGs 成顯著正相關(P<0.05),10 種菌屬與ARGs 成顯著負相關(P<0.05).徐秋鴻等研究認為當微生物與某些ARGs 呈顯著正相關關系,微生物可能是這些ARGs的潛在宿主;當微生物與某些ARGs 呈顯著負相關關系,微生物可能會影響這些ARGs 的水平轉移[24].

圖5 ARGs 與微生物群落間相關性Fig.5 Correlation between ARGs and microbial community

本研究中部分菌屬,如厭氧繩菌綱未分類屬(g_unclassified_c_Anaerolineae)、鞘脂單胞菌屬(g_Sphingopyxis)、伯克氏菌目未分類屬(g_unclassified_o_Burkholderiales)、奧托氏菌屬(g_Ottowia)及變形菌門未分類屬(g_unclassified_p_Proteobacteria),與多種ARGs 顯著正相關,涉及多種耐藥機制,表明這些微生物可能是多種ARGs 的共同潛在宿主,可能對ARGs 的分布特征和水平轉移產生影響,導致細菌產生多重耐藥性[25].而部分ARGs 與多個菌屬之間呈顯著正相關,如patA、macB、brcA、oleC、mtrA及baeS,表明這些ARGs 可能有多個潛在的微生物宿主[26].

3 結論

3.1 硝化污泥處理EE2 過程中ARGs 豐度提高了724.42TPM,ZVI削減了此增長趨勢,EE2及ZVI改變了ARGs 亞型的分布,但對ARGs 類型及亞型種類無明顯影響.

3.2 ZVI 降低了硝化污泥中的抗性風險,多重耐藥是硝化污泥中豐度占比最大的高風險(Q1 和Q2 等級)ARGs 類型,占比49.23%.

3.3 微生物群落是硝化污泥中ARGs 的重要驅動因子,鞘脂單胞菌屬(Sphingopyxis)等菌屬與多種ARGs 顯著正相關,可能是多種ARGs 的共同潛在宿主.