微塑料與肺表面活性物質相互作用

蔣凡殊,曹 妍,張林豐,師偉萌,宋浩然,王浩駿,楊艷琳,趙 群,李 杰,李曼燾(昆明理工大學環境科學與工程學院,云南 昆明 650500)

由于價格低廉、可塑性強、質量較輕等優勢,塑料制品被廣泛應用于農業生產、食品包裝、醫療和建筑等行業[1].然而,由于處理不當和廢物管理不足等問題,大量塑料垃圾在環境中不斷積累[2].在風化、降解和微生物介導等因素的作用下,塑料會逐漸分解成小顆粒、碎片和纖維,形成性質穩定、難以降解的微塑料[3].目前,微塑料污染不僅存在于人類活動密集的地區,還存在于人口稀少的地區,這顯然是一個不可忽視的環境健康問題[4].微塑料能通過多種途徑富集于人體,進而對健康產生負面影響[5].然而,目前關于微塑料污染對人體健康的潛在風險的認識仍十分有限.

呼吸暴露是微塑料進入人體的主要途徑[6].通過呼吸作用,粒徑小于2.5 μm 的微塑料易被吸入肺部[7],并在肺組織深層處積累[8].一旦微塑料到達肺泡區域,就會首先與肺泡內襯層的肺表面活性物質(LS)相接觸[9].LS 是由肺泡Ⅱ型上皮細胞合成、分泌的,由脂質(85%～90%,主要為二棕櫚酰磷脂酰膽堿)和脫輔基蛋白(10%)組成的復合物,覆蓋在肺泡表面[10],其生理功能主要為降低肺泡表面張力,確保呼吸過程中肺泡不會過度膨脹或者塌陷;維持肺泡穩定,增加了呼吸的順應性[11]以及機體防御等方面,是維持正常呼吸必不可少的關鍵物質[12].

吸附作用是顆粒物改變LS 體系組成,干擾LS界面化學性質的途徑之一.Wu 等[13]的研究指出,吸入的顆粒物會對LS 中的活性物質產生吸附,從而改變LS 的組成體系,擾亂LS 的界面化學性質,造成其生理功能的異常.此外,LS 也會改變顆粒物的物化性質,這在進一步影響其吸附性能的同時,還會造成其遷移歸趨和健康效應的改變[14].然而,關于微塑料入肺后與LS 間的相互作用尚未被完全闡明,微塑料暴露與肺功能異常間的證據仍然匱乏.

因此,本文采用了體外模擬的方法,選取在人體的肺組織中被檢測出[8],且在生產生活中廣泛使用的聚氯乙烯(PVC)和聚乙烯(PE)為微塑料的代表,探究其與LS 間的相互作用關系,再通過提取更接近人體肺部情況的動物源肺表面活性物質進行實驗,以期反應出更真實的界面化學變化.通過吸附、表面張力、起泡性能以及π-A 等溫線實驗,探究了微塑料對LS界面化學性質的影響.同時,通過掃描電子顯微鏡以及布魯斯特角顯微鏡(BAM),從微觀角度觀察到了微塑料形態的變化以及界面處磷脂分子的排布情況,進一步探究了微塑料受LS影響的分散情況,評估了微塑料在肺環境內的遷移歸趨.本文有利于深入了解微塑料暴露的條件下對于LS 產生的多種不利影響以及微塑料對于肺健康體系產生的潛在毒性作用.

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

在Bernahard 等[15]提取方法的基礎上,采取全肺灌洗和有機溶劑萃取結合的方法制備LS.首先用冷生理鹽水(4℃)反復灌洗由當地屠宰場購買的新鮮未嗆血的豬肺,再將收集到的灌洗液經過濾、離心、氯仿提取、濃縮和冷凍干燥處理,即可得到白色蠟狀的PS 純品.牛血清蛋白(BSA,純度AR)購自北京百靈威科技有限公司;二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC,純度≥99%)購自Sigma 公司;實驗用水均為超純水;聚乙烯(純度AR)和聚氯乙烯(純度AR)均購自于北京百靈威有限公司;總蛋白檢測顯色劑(考馬斯亮藍)購自于南京建成生物工程研究所;氯化鈉、三氯甲烷、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、六水合三氯化鐵、硫氰酸銨均為分析純,購自于阿拉丁試劑有限公司.所有實驗均使用磷酸鹽緩沖液(PBS,114mmol/L NaCl、7.8mmol/L Na2HPO4、2.2mmol/L KH2PO4,pH= 7.3 ± 0.1)為溶劑[16].

1.2 微塑料對LS 組分的吸附

在頂空瓶中加入LS 和BSA,以PBS 緩沖液作為溶劑,控制總體積為20mL,使LS 和BSA 能夠充分溶解,確保LS 的最終濃度均為100mg/L,控制磷脂與蛋白組分的比例為9:1[17].再分別添加適量的PVC、PE顆粒,使得微塑料的含量為0.2,0.4,0.6,0.8 和1mg/L,每5 個濃度梯度與1 個空白對照形成一個實驗組,每個實驗組進行3 次重復實驗.將頂空瓶密封后放入水浴恒溫搖床中,在(37 ± 0.5)℃下以(120 ±5)r/min 的速度振蕩24h,取出樣品后,再在(37 ±0.5)℃的條件下以3000r/min 速度離心20min,再于(37 ± 0.1)℃靜置3h.

磷脂含量測定:根據以往的研究[18],磷脂可以與硫氰亞鐵銨反應形成配位化合物,該化合物在465nm 范圍有明顯的吸收峰,因此可對磷脂進行定量分析.在5mL 的上清液中加入5mL 氯仿和2mL的0.1mol/L 的硫氰亞鐵銨溶液,混均后在(37 ±0.5)℃下以3000r/min 離心2min,抽取3mL 氯仿溶液用紫外分光光度計測定其在467nm 處的吸光度值,代入標準曲線(A=0.0131C-0.0098,R2=0.9993,A 為吸光值;C 為溶液中活性組分濃度)進行即可求出磷脂的含量.

蛋白質含量測定:依據Bradford 的考馬斯亮藍法[19],蛋白質可與考馬斯亮藍相結合,對總蛋白的量在紫外分光光度計上595nm 處進行測量.通過移取靜置后溶液的上清液2mL 再加入4mL 蛋白顯色劑溶液(溶液與顯色劑比例為1:2),混均后測量吸光度值.代入標準曲線(A=0.0057C-0.0041,R2=0.9991,A為吸光值;C 為溶液中活性組分濃度)進行即可求出活性蛋白的含量.

1.3 表面張力實驗

在含有20mL 的LS(100mg/L)溶液中加入適量的PVC/PE 顆粒,控制PVC/PE 顆粒的含量為0,0.2,0.4,0.6,0.8 和1mg/L.將樣品溶液密封后,在(37 ±0.5)℃下以(120 ± 5)r/min 的轉速振蕩24h,振蕩結束后,在(37 ± 0.1)℃下以3000r/min轉速離心20min并靜置6h,然后通過表面張力儀(美國科諾工業有限公司,A60)Wilhelmy 板法測定和記錄溶液的表面張力.

1.4 表面壓力-面積(π-A)等溫線

適量LS 加入到氯仿溶液中配制成0.8mg/mL 的LS 的儲備膜液.PBS 為溶劑制備亞相溶液,根據實驗組向亞相溶液中添加一定量的PVC和PE,使微塑料的最終濃度分別為0,0.5 和1mg/L,將其在(37 ± 0.5)℃下超聲分散30min 使其充分分散在亞相溶液中.

取 265mL 亞相溶液((37±0.5)℃)加入到Langmuir-Wilhelmy 膜天平(上海中晨數字技術設備有限公司,JML04C2)的矩形槽(280×100mm)中,然后取30 μL 的儲備膜液均勻地滴加鋪開在亞相溶液的表面,等待三氯甲烷完全揮發,靜置15～20min 后,調節儀器參數,使其在氣液界面以15mm/min的速率對稱壓縮兩個聚四氟乙烯滑障,壓縮至液槽表面積剩余10%,同時設備將自動記錄LS 膜的表面壓力-表面積關系曲線(即π-A 等溫線).

1.5 掃面電鏡分析及Zeta 電位分析

配置微塑料濃度為1mg/L 的PBS+LS、PBS+BSA、PBS+DPPC 和PBS(對照組)的溶液.將樣品溶液超聲處理 30min,在(37±0.5)℃下以(120±5)r/min 的速度振蕩24h,然后通過掃描電子顯微鏡(美國FEI 有限公司,Nova Nano SEM-450)進行觀測和Zeta 電位分析儀(美國Brookhaven 公司,90Plus Zeta)進行分析.

1.6 數據處理

每組實驗均做空白和平行實驗,以保證實驗結果的準確性.數據表示為平均值±標準偏差.通過Pearson 相關分析用于確定不同暴露濃度之間的關系.所有統計分析和繪圖均在OriginPro 軟件(2018C版)中進行,P<0.05 被認為具有統計學意義.

2 結果與討論

2.1 微塑料對LS 的影響

2.1.1 微塑料對LS 中活性組分的吸附 肺泡區的顆粒物通過吸附作用影響LS 脂蛋白體系的構成,是其干擾正常呼吸功能的重要機制,在此,分別對磷脂和蛋白質在PE、PVC 上的吸附行為進行了評估.如圖1所示,與不含微塑料的LS(100mg/L)溶液相比,PE(圖1a)和PVC(圖1b)存在時,磷脂濃度顯著下降(P<0.01)且與微塑料的添加量之間存在顯著的負相關關系(P<0.01).該實驗結果表明,微塑料對LS 中的磷脂組分具有吸附能力,其中PVC和PE對磷脂組分的吸附率可分別達到49.33%和47.00%,這可歸因于微塑料與脂質間的范德華作用[20].

圖1 不同濃度(a)PE 和(b)PVC 對LS 中磷脂的吸附Fig.1 Adsorption of phospholipids in LS by various concentrations of(a)PE and(b)PVC

如圖2所示,微塑料對蛋白質表現出不同于磷脂組分的吸附行為.如圖2a 和2b所示,上清液中的蛋白組分含量雖未隨微塑料添加量的增加而降低(P>0.01),但與不含微塑料的空白組相比,PE 和PVC的存在仍顯著降低了溶液中蛋白的含量.Wen 等[21]的研究表明,蛋白質能夠在納米粒子表面形成蛋白質電暈,電暈層的形成能夠阻止了更多蛋白分子的吸附,這可能是微塑料對蛋白質組分吸附情況較為復雜的原因.

圖2 不同濃度(a)PE 和(b)PVC 對LS 中蛋白組分的吸附Fig.2 Adsorption of protein components in LS by various concentrations of(a)PE and(b)PVC

綜上可知,磷脂和活性蛋白組分作為LS 正常生理功能的基礎,而微塑料可以通過吸附磷脂和活性蛋白組分改變LS 的脂蛋白體系的構成,從而影響正常的呼吸功能.

2.1.2 微塑料顆粒對LS 起泡能力的影響 起泡性能是評價表面活性物質界面化學性質的重要指標,可用于探索LS 受污染物影響后膜穩定性的變化情況,對肺功能的評估具有重要意義.因此,研究進一步考察了微塑料對LS 起泡能力的影響,其結果如圖3所示.PE(圖3a)、PVC(圖3b)均對LS 的起泡能力產生了影響,且微塑料的濃度與泡沫體積之間存在著顯著的正相關關系(P<0.01).前期研究已經證實,LS中含量較少的活性蛋白組分是其起泡性能的關鍵組分[22].然而,根據蛋白吸附的實驗結果來看,微塑料理應具有削弱LS 發泡性能的潛力,但這明顯與圖3所示的實驗結果不符,推測這可能是由于微塑料對蛋白吸附能力較差的原因.AlYousef 等[23]的研究表明,細小的塑料顆粒物可能會負載在氣泡的表面形成不規則的排列,進而通過抑制氣泡間的氣體擴散和減緩液體排出來增強泡沫穩定性.此外,也有研究指出,固體顆粒可以吸附并聚集在氣-液界面形成物理屏障,增大液膜中的流體阻力進而防止起泡的合并與聚集時間[24],這可能也是微塑料增加LS 發泡能力的主要原因.

圖3 (a)PE 和(b)PVC 濃度對LS 發泡體積的影響Fig.3 Effect of(a)PE and(b)PVC concentrations on the foaming volume of LS

2.1.3 微塑料顆粒對LS 表面張力的影響 降低肺泡表面張力是LS 維持正常肺功能最為關鍵的物理化學性能指標,在此,探究了塑料顆粒物對LS表面張力的影響.從圖4 可以發現,隨著PE(圖4a)、PVC(圖4b)濃度的增加,LS 的表面張力隨之增大(P<0.01).以PVC 為例,LS 溶液中PVC 的含量在0.2 和1.0mg/L時,對應的表面張力由27.82升高到92.00mN/m,提高了約231%.在吸附實驗的部分,已證實PE 和PVC 均會對LS 中的磷脂組分產生較好的吸附效果(圖1),而磷脂是LS 中起降低表面張力的最重要組分.Geng等[25]的研究表明,顆粒物接觸磷脂會對其產生吸附作用,不僅會影響肺泡的收縮擴張,也會造成液膜層表面張力的升高,這與本研究的結果一致.由此可以推斷,PE 及PVC 導致LS 表面張力的升高與其對磷脂組分的吸附作用有關.因此,暴露于微塑料可能會通過改變LS 單層膜的表面張力而干擾正常的呼吸功能,最終誘導呼吸疾病的產生.

圖4 (a)PE 和(b)PVC 濃度對LS 表面張力的影響Fig.4 Effect of(a)PE and(b)PVC concentrations on surface tension of LS

2.1.4 塑料顆粒對LS 的π-A 等溫線影響 由膜天平獲取的LS 氣-液界面壓縮等溫線(π-A 等溫線),因與呼吸過程肺泡的壓縮/擴張過程類似而成為體外評估外源物質影響肺功能的常用方法[26].在此,對微塑料存在下LS 的π-A 等溫線的變化進行了測定.結果如圖5所示,隨著滑障對稱內移,氣液界面處LS 的膜不斷被壓縮,亞相表面磷脂分子間的間隙不斷減小,表面壓力也隨之升高.當 PE(圖5a)和PVC(圖5b)存在時,LS的π-A等溫線均出現了內縮現象,且隨著塑料顆粒含量增加,曲線整體向表面積減少的方向移動,即與純亞相溶液相比,微塑料的添加導致了LS膜相同表面積處對應表面壓力的明顯下降.Zhao等[27]研究表明,壓縮過程中LS 的表面壓力與氣-液界面處的成膜分子(主要是磷脂)的量呈正相關.據此可以推斷,PE 或PVC 存在下,LS 的π-A 等溫線出現內縮現象可能是由塑料顆粒物對磷脂的吸附作用導致的,這與Shi 等[28]研究聚苯乙烯對π-A 等溫線影響的結果類似.由于界面處成膜分子的減少,π-A 等溫線發生內縮,使得系統的彈性降低[29],進而造成呼吸功能障礙,甚至誘導肺部疾病.

圖5 (a)PE 和(b)PVC 存在下LS 的π-A 等溫線Fig.5 Surface pressure-area(π-A)isotherms of LS in the presence of(a)PE and(b)PVC

為進一步驗證微塑料的吸附作用與LS 單層膜π-A 等溫線之間的關系,經由布魯斯特角顯微鏡(BAM)對氣-液界面處LS 膜的微觀形貌進行了觀測.從圖6a可以發現,不含塑料顆粒的LS膜的成膜分子在界面處呈現均勻密集的排布.然而,當PE(圖6b)或PVC(圖6c)存在時,膜間雖有少量微塑料顆粒嵌入,但成膜分子的缺失也造成了較大面積空洞的出現,這是PE 或PVC 吸附作用導致LS 膜微觀形貌及其π-A 等溫線內縮的直接證據,這與表面張力變化(圖4)的研究結果一致.可見,吸入微塑料會對LS 活性組分產生吸附,這將破壞LS原有的結構和功能,進而導致潛在健康風險的發生.

圖6 原始(a)/存在(b)PE 和(c)PVC 的肺表面活性物質單層膜的BAM 圖像Fig.6 Brewster angle microscope(BAM)images of the lung surfactant monolayer in the absence(a)/ presence of(b)PE and(c)PVC

2.2 LS 對微塑料的影響

2.2.1 LS 對微塑料的表面形貌的影響 為獲取微塑料的相關信息,首先利用掃描電子顯微鏡(SEM)對兩種微塑料的表面形貌進行了觀測.由圖7 可知,PE(圖7a)與PVC(圖7b)的粒徑均在2.5μm 以下,屬于可入肺細顆粒物的范疇,因而能夠進入肺泡深處,從而與LS 相接觸.

圖7 (a)PE 和(b)PVC 的掃描電子顯微鏡(SEM)圖Fig.7 SEM images of(a)PE and(b)PVC

如圖8所示,磷脂的存在使得塑料顆粒的表面被覆蓋了一層粘稠狀的物質(圖8a,8c),這是磷脂被兩種微塑料吸附的直觀證據.此外,由圖8b 和8d 可知,相比清晰的磷脂包裹微塑料的SEM 圖像,蛋白質被微塑料吸附后的SEM 圖像相對模糊,這是由于PVC 和PE 周圍形成了一層動態的蛋白質電暈層的緣故.電暈層的形成不但使得微塑料顆粒趨于更加穩定的狀態,還阻止了其他蛋白質分子的吸附,這支持了我們之前關于蛋白吸附實驗的解釋.有研究指出,生物大分子的吸附通常伴隨著顆粒物的表面性質的改變,如表面電荷等,從而影響顆粒的穩定性和遷移歸趨[30].

圖8 (a)～(b)PE 和(c)～(d)PVC 在磷脂或蛋白存在下的SEM 圖像Fig.8 SEM images of(a)～(b)PE、(c)～(d)PVC in the presence of phospholipids or protein components

2.2.2 LS 對微塑料Zeta 電位的影響 Zeta 電位可用于度量顆粒之間相互排斥或吸附的強度,其絕對值越高,粒子越分散,體系越穩定;絕對值越低,粒子越傾向于凝結或凝聚[31].如圖9所示,加入LS 后,PE(圖9a)和PVC(圖9b)的Zeta電位絕對值均明顯下降(分別降低了5.61 和5.20mV).此外,研究還發現,LS 中的蛋白和磷脂組分也具有降低微塑料Zeta 電位絕對值的能力,這意味著LS 及其活性組分的存在可能會促使溶液中微塑料發生團聚,進而更有利于顆粒在肺內的沉積.基于之前微塑料對蛋白產生吸附的研究結果,我們認為少量的蛋白分子能夠在與微塑料顆粒接觸的過程中形成蛋白質電暈[32],電暈層的性質較為穩定且排列在顆粒物外圍,增強了其團聚的性能.Kendall等[33]研究表明,肺泡表面襯液會導致大氣顆粒物發生聚集,這有助于顆粒物的清除,但當顆粒物積累過多也會加重肺部環境的負荷,因而探究微塑料在受到LS 影響后的團聚/分散性能是很有必要的,更能深入了解微塑料對肺健康的潛在危害.

圖9 (a)PE 和(b)PVC 在四種體系中的Zeta 電位Fig.9 Zeta potential of(a)PE and(b)PVC in four media

2.2.3 LS 對微塑料沉降性能的影響 微塑料顆粒物的沉降性能是影響其在環境中遷移和歸趨的重要因素[34].如圖10所示,與空白組相比,當溶液中存在LS 及其活性組分時,PE(圖10a)和PVC(圖10b)的沉降速率均增大,其中LS 促進微塑料沉降的效果最明顯.結合LS 及其組分降低Zeta 電位的能力,我們發現LS 具有改變微塑料的穩定性,致使塑料顆粒趨于團聚,粒徑增大且加速沉降的能力,這可能歸因于生物大分子的吸附和橋連作用[35].微塑料沉降性能的增強將導致其在肺環境中發生積累,進而擴大其毒性效應,對呼吸系統產生危害.

圖10 LS 及其組分對(a)PE 和(b)PVC 沉降速率的影響Fig.10 Effect of LS and its components on the settlement rate of(a)PE and(b)PVC

3 結論

3.1 微塑料能夠通過吸附磷脂和蛋白來破壞LS 膜原有的結構和功能,進而造成LS 膜表面張力、π-A等溫線以及起泡性能的改變,最終干擾正常的呼吸功能,甚至誘發呼吸疾病的產生.

3.2 LS 及其活性組分(BSA 和DPPC)能夠通過吸附和橋連作用使得微塑料顆粒發生團聚,增大其沉降性能,進而導致其在肺環境中發生積累,擴大其生物毒性,造成更嚴重的健康危害.

3.3 揭示了微塑料與LS 相互作用過程中LS 界面化學性質以及微塑料自身物化性質的變化,有助于深入了解微塑料經呼吸暴露后產生的不利健康效應,為污染物入肺后造成的潛在危害提供了新的認識.然而,體外實驗的研究體系相對簡單,無法完全再現微塑料與真實肺部環境接觸后的復雜反應過程.因此,微塑料入肺后對人體產生的真實生物毒性將是我們未來研究的重點.