辛芳鼻炎膠囊對大鼠變應性鼻炎的改善作用

張 勇，張 斌，吳 瑕，宋 紋

（1.天津醫科大學總醫院中醫科，天津 300052； 2.黃驊神農居醫院中醫科，河北 滄州 061100； 3.天津宏仁堂藥業有限公司，天津 300385）

辛芳鼻炎膠囊主要由辛夷、白芷、細辛等10 余味藥物組成，常用于治療慢性鼻炎、鼻竇炎。早期研究已初步證實辛芳鼻炎膠囊具有抗炎，抗過敏等藥理作用［1］，近年來亦有該藥物用于治療變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）的散在臨床報道［2-3］，但目前尚未見該藥物干預AR 動物模型的實驗研究報道。本研究擬通過建立AR 大鼠模型，對辛芳鼻炎膠囊抗炎、抗過敏藥理作用及其干預機制進行初步研究，以期為擴大其臨床適應癥提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性SD 大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［實驗動物生產許可證號SCXK （京）2016-0006］，體質量160～200 g，分籠飼養于中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心空調動物房，室溫22 ～26 ℃，相對濕度55% ～65%，12 h／12 h 晝夜節律光照，自由進食、飲水，定期更換、消毒飼養籠，保持環境清潔，適應性飼養3 d 后開始實驗。本研究方案經過中國醫學科學院放射醫學研究所倫理委員會審核并通過（倫理號IRMDWLL-2020078）。

1.2 藥物與試劑 辛芳鼻炎膠囊（規格0.25 g／粒，批號BL09002，天津宏仁堂藥業有限公司）； 氯雷他定片［規格10 mg／片，批號JS12630，拜耳醫藥（上海）有限公司］。卵清蛋白 （OVA）、氫氧化鋁 ［Al （OH）3］（批號SLBX8657、WXBB1151，美國Sigma 公司）； 吸入用七氟烷（批號20011431，上海恒瑞醫藥有限公司）； 10%緩沖中性甲醛（批號B09D00119，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）； 大鼠OVA-sIgE、HIS、LTC4、IL-4、IFN-γ ELISA試 劑 盒 （ 貨 號 ML620587、ML002986、ML003188、ML102825、ML002833，上海酶聯生物科技有限公司）。

1.3 儀器 DNM-9602 型酶標儀［普朗科（北京）科技有限公司］； DM3000 型光學顯微鏡、DFC 420C 型顯微數碼成像系統（德國徠卡公司）； TL-18M 型臺式高速冷凍離心機（上海離心機械研究所有限公司）； AL204 型電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）。

2 方法

2.1 大鼠AR 模型的建立

2.1.1 全身致敏 參照宋興興等［4］報道的方法并加以改進，首先將OVA 溶于無菌生理鹽水 （終質量濃度為0.4 mg／mL），然后與等體積氫氧化鋁混懸液混合均勻，每只大鼠腹腔注射混合液l mL （含0.2 mg OVA 和20 mg 氫氧化鋁），隔日致敏1 次，連續致敏7 次； 對照組大鼠腹腔注射等體積無菌生理鹽水。

2.1.2 鼻腔激發 第15 天至第21 天，大鼠經七氟烷吸入短暫全身麻醉后，以5% OVA 溶液雙側滴鼻，每次50 μL／鼻孔，每天1 次，對照組大鼠以等體積生理鹽水滴鼻。在末次滴鼻完成后，觀察大鼠噴嚏、抓鼻及流涕情況，按趙氏疊加量化計分法［5］進行評估，觀察時間30 min，總分≥5 分表示造模成功。評分標準為①鼻癢，大鼠抓鼻1 ～5次記為1 分，6～10 次記為2 分，10 次以上記為3 分； ②噴嚏，大鼠打噴嚏4 個以下記為1 分，4～10 個記為2 分，10個以上記為3 分； ③流涕，大鼠鼻涕流至鼻前孔記為1 分，超過鼻前孔記為2 分，涕流滿面記為3 分。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、陽性對照組（氯雷他定）及辛芳鼻炎膠囊低、中、高劑量組，每組8 只。

2.2 藥物干預 所有藥物事先均以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液懸浮，使用前充分搖勻，其中辛芳鼻炎膠囊低、中、高劑量分別為0.25、0.5、0.75 g／kg，氯雷他定劑量為1 mg／kg［6］。自第22 天（造模結束24 h 后）開始，各給藥組大鼠分別灌胃給予相應藥物混懸液，對照組及模型組大鼠均予以等量0.5% CMC-Na 溶液灌胃，每天1次，連續干預14 d。

2.3 行為學觀察 末次給藥結束后，按照“2.1.2” 項下評分標準，再次對大鼠進行行為學觀察和評分，觀察時間30 min。

2.4 標本采集 第36 天（干預結束24 h 后），所有大鼠經10%水合氯醛溶液（300 mg／kg）腹腔注射麻醉后，腹主動脈取血5 mL，置于含有惰性分離膠和促凝劑的真空取血管中靜置2 h 后，3 000 r／min 離心15 min，血清經分裝后置于-40 ℃保存備用。取血完畢后迅速沿鼻中線剪開大鼠鼻腔，暴露鼻中隔及雙側鼻腔，提取鼻中隔（含鼻中隔軟骨及其雙側黏膜），置于10% 緩沖中性甲醛溶液中固定72 h。

2.5 鼻黏膜組織病理觀察 鼻黏膜組織標本放入5%甲酸溶液中脫鈣3 d，梯度乙醇脫水，透明，石蠟包埋，切片（厚度4 μm），HE 染色后封片，于光學顯微鏡下觀察鼻腔組織內覆蓋各部位的黏膜上皮細胞有無變性、壞死，黏膜下有無充血、水腫及炎細胞浸潤，鼻腔內有無炎性分泌物等。

2.6 細胞因子水平檢測 采用ELISA 法檢測大鼠血清OVA-sIgE、HIS、LTC4、IL-4 及IFN-γ 水平，嚴格參照試劑盒說明書操作，于酶標儀450 nm 波長處讀取吸光度，采用標準曲線法計算相應細胞因子濃度值。

2.7 統計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較方差齊性時采用LSD 檢驗，方差不齊時則采用Tamhane 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 辛芳鼻炎膠囊對AR 大鼠一般情況的影響 在造模階段，對照組大鼠飲食及日常行為活動無異常，被毛光亮柔順，無頻繁的噴嚏、抓鼻、流涕等表現； 與對照組比較，其余各組大鼠體質量減輕，活動力下降，常可看到前鼻孔甚至瞼結膜潮濕，頻繁出現噴嚏、抓鼻動作，部分大鼠可見血性鼻涕，少數大鼠還會出現一過性喉中哮鳴音。

3.2 辛芳鼻炎膠囊對AR 大鼠行為學評分的影響 如表1所示，給藥前，各給藥組與模型組大鼠行為學評分比較無差異（P＞0.05）。給藥結束后，與對照組比較，模型組大鼠行為學評分升高（P＜0.05）； 與模型組比較，辛芳鼻炎膠囊中、高劑量組以及陽性對照組大鼠行為學評分降低（P＜0.05）。

3.3 辛芳鼻炎膠囊對AR 大鼠鼻黏膜組織病理學變化的影響 對照組大鼠鼻黏膜組織結構完整清晰，表面覆有假復層柱狀纖毛上皮，上皮間有多量分泌黏液的杯狀細胞，上皮細胞排列整齊，平滑，沒有杯狀細胞増生，黏膜下層腺體正常，未見增生，無嗜酸性粒細胞、中性粒細胞等炎性細胞侵潤，血管無擴張充血； 模型組大鼠鼻黏膜上皮細胞有不同程度的脫落、壞死，杯狀細胞增生，出現明顯的小血管擴張和組織間隙水腫現象，存在以嗜酸性粒細胞為主的炎細胞廣泛浸潤，腺體增生、腫脹，黏膜表面分泌物增多； 各給藥組大鼠鼻黏膜較模型組有不同程度的改善，炎性浸潤，小血管擴張和組織間隙水腫均減輕，其中陽性對照組和辛芳鼻炎膠囊中、高劑量組變化相近，見圖1。

圖1 各組大鼠鼻黏膜組織病理學觀察（HE，×400）

3.4 辛芳鼻炎膠囊對AR 大鼠血清OVA-sIgE、LTC4、HIS、IL-4I 及FN-γ 水平的影響 如表2 所示，與對照組比較，模型組大鼠血清OVA-sIgE、LTC4、HIS 及IL-4 水平升高（P＜0.05），IFN-γ 水平降低（P＜0.05）； 與模型組比較，辛芳鼻炎膠囊中、高劑量組及陽性對照組大鼠血清OVA-sIgE、LTC4、HIS 及IL-4 水平降低（P＜0.05），IFN-γ水平升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清OVA-sIgE、HIS、LTC4、IL-4 及IFN-γ 水平比較（x±s，n＝8）

4 討論

AR 又稱過敏性鼻炎，是人體接觸變應原后，由免疫球蛋白E （IgE）介導而涉及多種免疫細胞和炎癥因子共同參與的鼻黏膜非感染性疾病，屬于Ⅰ型變態反應性疾病［7］。該病典型癥狀為陣發性噴嚏，大量清水樣涕，鼻癢及鼻塞等，其發病率占整個人群的10% ～20%［8］。

AR 發病機制錯綜復雜，至今尚未完全明確，已知當機體首次接觸變應原后，經抗原呈遞細胞傳遞給Th 細胞，并分化為Th2 細胞，Th2 細胞進而誘導B 細胞分泌IgE 并聚集于鼻黏膜。當變應原再次進入機體內時，將會與IgE 結合，誘發肥大細胞脫顆粒后釋放組胺、白三烯等炎性遞質，促進嗜酸粒細胞浸潤，致使鼻黏膜上皮細胞損傷，毛細血管擴張，通透性增高，腺體分泌增加，引起鼻塞、噴嚏、流涕等癥狀［9］。體內IgE 異常表達是誘發此類鼻炎的主要原因，且血清總IgE 水平與患者病情嚴重程度呈正相關［10］。已有研究表明，組胺是引起機體過敏反應的重要的血管活性物質，其在體內具有促進血管擴張、增強毛細血管通透性及腺體分泌增加等效應，介導了I 型變態反應的發生［11］。氯雷他定作為第二代抗組胺藥物，具有抑制肥大細胞釋放白三烯和組胺等藥理作用，是當前治療AR 的一線口服藥物，故本研究將其作為陽性對照藥物。目前普遍認為Th1／Th2 細胞免疫失衡是引起AR 的關鍵［12］，Th1 細胞主要分泌IL-2、IFN-γ 等細胞因子以參與細胞免疫應答； Th2 細胞主要分泌IL-4、IL-5 等細胞因子以參與體液免疫應答，其中IL-4 能夠促進β 細胞轉變為漿細胞合成IgE，抑制IFN-γ 產生； 而IFN-γ 是IL-4 合成的生物拮抗劑，能增強Th1 細胞活性，抑制β 細胞合成IgE 和抑制Th0 細胞分化Th2 型細胞［13］，IL-4 和IFN-γ 常作為監測Th 反應的檢測指標。當特異性抗原作用于特應性個體時，抗原信號呈遞給T 輔助淋巴細胞，使Th 細胞分化發生偏移，從而導致Th1／Th2 細胞因子網絡平衡失調，出現Th2＞Th1 反應［14］。

現代藥理研究表明，辛夷的主要有效成分辛夷油能夠抑制Th2 細胞介導的免疫效應，減少組胺的釋放，并且能夠上調Thl／Th2 的比值，促進IL-4、干擾素的表達，從而對AR 發揮一定的治療作用［15］。柴胡中的柴胡皂苷可抑制炎癥組織中組胺的釋放，抑制白細胞游走［16］。防風的提取物能減少致敏小鼠血清IgE 的產生，從而延遲或減輕由卵蛋白致敏引起的I 型變態免疫反應［17］。有研究表明，白芷內的揮發油不但能夠抑制AR 患者肥大細胞脫顆粒，而且還能夠有效地對抗組胺引起的致炎反應，降低毛細血管通透性，減輕或消除AR 癥狀［18］； 另有報道稱，白芷干預AR小鼠后，能有效改善小鼠的過敏性鼻炎癥狀，減輕其鼻黏膜組織損傷，其機制可能與下調Th17 比例，上調Treg 比例，恢復Th17／Treg 平衡有關［19］。有研究表明，黃芩的主要活性成分黃芩苷可調節Th1／Th2 細胞失衡，抑制IL-33／ST2 信號通路，對AR 治療作用明顯［20］； 另有報道稱，黃芩苷能夠緩解OVA 誘導的小鼠AR 癥狀，其機制與通過抑制細胞自噬來調控Th17／Treg 細胞分化平衡有關［21］。

本研究證實辛芳鼻炎膠囊可明顯改善AR 大鼠鼻黏膜癥狀，其機制與降低血清中OVA-sIgE、LTC4、HIS 和IL-4水平，升高血清IFN-γ 水平有關。