薏苡附子敗醬散通過調控NF-κB 信號通路對結腸炎癌轉化模型小鼠結腸癌發生的影響

楊利梅，張影茹，于 浩，朱惠蓉，2*，王 炎*

（1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院腫瘤研究所，上海 201203； 2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院腫瘤科，上海 201203）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球發病率第三、死亡率第二的惡性腫瘤。2018 年，我國結直腸癌新發病例51.83 萬例［1］。炎癥性腸病 （inflammatory bowel disease，IBD）是結腸癌發展的重要危險因素［2-3］，“炎癥-異常隱窩-腺瘤-癌癥” 是結腸炎相關結直腸癌發生的基本路徑，促炎細胞因子通過激活促生存和增殖途徑加速腫瘤的發生和發展［4-5］，因此，控制“炎-癌轉化” 對防治CRC意義重大。“既病防變” 是中醫藥治療疾病的重要思想理論，結腸炎癌轉化具有起病緩、病程長的特點，因而對腸道炎癥遷延階段進行早期干預是抑制腸炎發展為腸道實體瘤形成的重要方法［6］。

薏苡附子敗醬散出自《金匱要略》，是治療腸癰的代表方。當代醫家多用此方治療消化道慢性炎癥性疾病［7］。課題組前期研究發現，薏苡附子敗醬散可以預防炎癥相關結腸癌的發生，并從腸道微生物群和免疫等方面對其機制進行了研究［8-9］。目前許多研究發現，中藥可以調節IL-5、IL-6、IL-17、IL-10、IL-2 和IFN-γ 等炎性因子的表達［10-11］，同時NF-κB 作為可以被炎性介質激活致癌的轉錄因子，在連接炎癥和致癌作用方面起關鍵作用，許多天然藥物可以通過抑制NF-κB 信號通路活化抑制癌變［12-13］。因此，本研究將從炎性微環境角度對薏苡附子敗醬散干預結腸癌的作用進行驗證，并從NF-κB 信號通路探討薏苡附子敗醬散預防結腸癌發生的機制。

1 材料

1.1 動物 72 只SPF 級C57BL／6J 雌性小鼠，6 ～8 周齡，體質量16 ～18 g，購自上海吉輝實驗動物飼養有限公司［實驗動物生產許可證號SCXK （滬）2017-0012］，飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心，飼養室恒溫20～22 ℃，相對濕度45% ～70%，光照周期12 h，自由飲食，適應性飼養1 周后進行實驗。各項實驗操作均嚴格遵守上海中醫藥大學實驗動物倫理委員會的相關規定 （倫理號PZSHUTCM210528005）。

1.2 藥物 苡附子敗醬散由薏苡仁30 g （批號210608）、附子6 g （批號210414）、敗醬草15 g （批號210201）組成，購自上海中醫藥大學附屬曙光醫院藥房。藥材先用清水浸泡30 min，大火煮沸后小火煎煮40 min，過濾，藥渣再加水2 次煎煮40 min，過濾，合并2 次藥液，蒸發濃縮至約150 mL，配制成質量濃度為0.386、0.774、1.547 g／mL的藥液（按每只小鼠20 g 計算給藥量，每天每只小鼠給藥0.2 mL），用50 mL 離心管分裝后于-20 ℃冰箱保存，使用前4 h 于4 ℃冰箱中解凍，每2 周配制1 次新鮮藥液。阿司匹林腸溶片（批號J20171021）購自德國拜耳公司，取600 mg 阿司匹林腸溶片搗碎成粉末狀，加入100 mL 純水和100 mL 1%CMC-Na，使用渦旋振蕩儀振蕩混勻，配制成3 mg／mL 的阿司匹林溶液（根據阿司匹林人臨床用量每天200 mg 和人鼠劑量系數9.1 換算得到），于-4 ℃下保存。

1.3 試劑 氧化偶氮甲烷 （azomethane，Aom，貨號A5486，美國 Sigma 公司）； 2.5% 葡聚糖硫酸鈉（dextransulfatesodium，DSS，貨號 9011-18-1，美國 MP Biomedicals 公司）； 0.9% 氯化鈉（批號H20023146，華仁藥業股份有限公司）； IKB、p-IKBα、NF-κB p65 一抗（貨號4814S、2859S、3033S，美國CST 公司）； IL-5、IL-6、IL-10、IL-17、IL-2、γ 干擾素（IFN-γ）ELISA 試劑盒（貨號MEI020S、MEI021、MEI025、MEI029、MEI016、MEI004，上海博谷生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 小鼠按隨機數字表法分成空白組、模型組、阿司匹林組和薏苡附子敗醬散低、中、高劑量組，每組12 只，除空白組外，其余各組小鼠一次性腹腔注射誘變劑Aom （10 mg／kg）。正常飲水1 周后，給予2.5% DSS 連續飲用7 d （每2 d 更換1 次新鮮的DSS），繼續恢復正常飲水2 周，以此為1 個DSS 周期，共進行3 個DSS 周期循環［14-15］。從給予DSS 飲用的第1 天開始藥物干預，薏苡附子敗醬散低、中、高劑量組灌胃給予3.87、7.74、15.47 g／kg 藥液0.2 mL （根據薏苡附子敗醬散臨床成人的有效劑量每天0.85 g／kg 和人鼠劑量系數9.1 換算得到劑量為7.74 g／kg，設為中劑量，以中劑量的0.5、2 倍為低、高劑量，即3.87、15.47 g／kg）； 阿司匹林組給予30 mg／kg 阿司匹林溶液0.4 mL； 模型組給予0.2 mL 等體積純水，每天1 次，連續12 周。

2.2 小鼠一般情況和DAI 評分 實驗過程中隔天觀察并記錄小鼠的一般狀態、毛發光澤、活動情況、大便性狀等，每2 d 稱量1 次體質量，通過體質量下降百分率、大便性狀分數、便血分數3 項指標進行進行DAI 評分［16］，評分標準見表1。

表1 DAI 評分標準

2.3 樣本采集和脾臟指數計算 給藥結束后，采集小鼠血液樣本并制備血清，用于血清炎性因子檢測； 采集結腸組織樣本，觀察記錄結腸組織大體形態，拍照并記錄大腸內腫瘤數目、大小、結腸長度和脾臟狀態； 結腸組織一部分于-80 ℃冰箱中保存，用于Western blot 實驗； 另一部分于4%多聚甲醛中固定，用于HE 染色； 采集脾臟樣本，計算脾臟指數，公式為脾臟指數＝脾臟質量／體質量×10。

2.4 HE 染色觀察結腸組織病理變化并進行組織學評分取固定于4%多聚甲醛中的結腸組織，經常規脫水、石蠟包埋、切片（4 μm），二甲苯透明，乙醇梯度脫水后，按照HE 試劑盒說明書進行HE 染色，中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察結腸黏膜組織形態，并根據炎癥、肉芽腫、潰瘍、纖維化、病變深度、上皮內瘤變情況進行評分［17-19］，無潰瘍、無炎癥、無肉芽腫、無纖維化、無病變，為0 分；小潰瘍＜3 mm、輕度炎癥、有肉芽腫、病變局限于黏膜下層，為1 分； 大潰瘍≥3 mm、重度炎癥、病變深度達肌層、重度纖維化，為2 分。

2.5 炎性因子水平檢測 按照試劑盒說明書，采用ELISA法檢測血清炎性因子IL-5、IL-6、IL-17、IL-10、IL-2、IFNγ 水平。

2.6 Western blot 法檢測NF-κB p65、IKB-α 蛋白表達 取結腸部位腫瘤組織，提取總蛋白，采用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，加入5×loading buffer，100 ℃煮沸10 min 使蛋白變性。采用SDS-PAGE 凝膠電泳，再將蛋白轉至PVDF 膜上，5% BSA 室溫封閉2 h，加稀釋后的一抗NF-κB p65、IKBα、p-IKB-α 及GAPDH，4 ℃冰箱孵育過夜，TBST 洗滌后，加稀釋后的HRP-山羊抗兔IgG 孵育2 h，TBST 洗滌后，使用超敏ECL 化學發光試劑盒，通過凝膠成像系統對蛋白印跡進行顯影，通過Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值／GAPDH 條帶灰度值為目的蛋白的相對表達量。

2.7 統計學分析 通過SPSS 23.0 軟件進行處理，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 薏苡附子敗醬散對小鼠一般情況的影響 模型組小鼠在飲用DSS 期間均出現不同程度的消瘦、蜷縮、動作遲緩、腹瀉、便血、脫肛等癥狀，更換正常飲用水后逐漸緩解，但總體癥狀隨造模時間逐漸加重； 薏苡附子敗醬散組小鼠在飲用DSS 期間一般狀態優于模型組，且停飲后精神狀態、體質量、腹瀉等情況恢復更快。

3.2 薏苡附子敗醬散對小鼠DAI 評分、體質量和生存率的影響 空白組小鼠體質量平穩增長，其余各組小鼠體質量均隨著DSS 的攝入持續下降，在停藥后1 周左右逐漸恢復正常水平，與模型組比較，薏苡附子敗醬散組小鼠體質量下降較少，且恢復較快，見圖1A。第13 周末對各組小鼠疾病活動指數進行評分，模型組小鼠DAI 評分高于空白組，而薏苡附子敗醬散各劑量組DAI 評分低于模型組，其中高劑量組最低（P＜0.01），見圖1B。模型組生存率較空白組降低，實驗結束時12 只小鼠只存活5 只； 薏苡附子敗醬散干預后小鼠生存率高于模型組，其中高劑量組（存活9 只）生存率最高且高于阿司匹林組（存活7 只），實驗結束時，薏苡附子敗醬散中、低劑量組分別存活8 只和6 只，見圖1C。

圖1 薏苡附子敗醬散對小鼠DAI 評分、體質量和生存率的影響（±s，n＝5）

3.3 薏苡附子敗醬散對小鼠成瘤率、結腸長度和脾臟指數的影響 與空白組比較，模型組小鼠結腸出現瘤體； 與模型組比較，薏苡附子敗醬散中、高劑量組和阿司匹林組結腸組織中腫瘤數量減少（P＜0.01），其中高劑量組效果最好（P＜0.01），見圖2A～2B。與空白組比較，模型組脾臟指數降低（P＜0.01）； 與模型組比較，薏苡附子敗醬散各劑量組和阿司匹林組脾臟指數均升高（P＜0.01），見圖2C。與空白組比較，模型組結腸長度縮短（P＜0.05）； 與模型組比較，薏苡附子敗醬散各劑量組和阿司匹林組結腸長度均增長（P＜0.05，P＜0.01），見圖2D。以上結果表明，薏苡附子敗醬散可以預防結直腸腺瘤的發生。

圖2 薏苡附子敗醬散對小鼠成瘤率、結腸長度和脾臟指數的影響（±s，n＝5）

3.4 薏苡附子敗醬散對小鼠結腸組織病理學的影響 如圖3 所示，空白組小鼠結腸黏膜組織結構完整，腺體排列規整，可見隱窩與杯狀細胞，黏膜下層無充血與水腫，未見病變及炎癥現象； 與空白組比較，模型組結腸組織可見黏膜上皮部分缺損，腺體結構紊亂或消失，大量炎性細胞浸潤，且肌層纖維化明顯，隱窩分支不規則，腫瘤惡性程度高； 與模型組比較，阿司匹林組結腸組織結構部分紊亂，部分腺體遭到破壞，可見少量炎性細胞，病理組織學評分降低（P＜0.01）； 薏苡附子敗醬散各劑量組結腸肌層稍見增厚，隱窩腔較為完整，杯狀細胞明顯，炎性程度和腫瘤惡性程度減輕，病理組織學評分降低（P＜0.05，P＜0.01），其中高劑量組改善效果最好。

圖3 薏苡附子敗醬散對小鼠結腸組織病理學的影響（x±s，n＝5）

3.5 薏苡附子敗醬散對小鼠血清炎性因子水平的影響 如圖4 所示，與空白組比較，模型組血清促炎因子IL-17 水平升高（P＜0.05），促炎因子IL-5、IL-6 水平升高，但差異無統計學意義（P＞0.05），抑炎因子IL-2 水平降低（P＜0.05），IL-10、IFN-γ 水平降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）； 與模型組比較，薏苡附子敗醬散低劑量組血清IL-5水平降低（P＜0.05），薏苡附子敗醬散中劑量組血清IL-5、IL-6、IL-17 水平降低 （P＜0.05），IL-10 水平升高 （P＜0.05），薏苡附子敗醬散高劑量組血清IL-5、IL-6、IL-17 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），IL-2、IL-10、IFN-γ 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），阿司匹林組血清IL-5、IL-6 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

3.6 薏苡附子敗醬散對小鼠結腸腫瘤組織NF-κB 信號通路相關蛋白表達的影響 如圖5 所示，與模型組比較，薏苡附子敗醬散各劑量組和阿司匹林組大鼠結腸腫瘤組織NFκB p65、IKBα 和p-IKBα 蛋白表達降低 （P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 薏苡附子敗醬散對小鼠結腸腫瘤組織NF-κB 信號通路相關蛋白表達的影響（±s，n＝5）

4 討論

本研究發現各劑量薏苡附子敗醬散均能不同程度地改善小鼠的一般狀態，降低DAI 評分，減輕結腸黏膜水腫、充血、炎癥、潰瘍等損傷，降低結腸長度縮短程度，升高脾臟指數，在數量和大小上減少結直腸腺瘤發生，在組織病理學層面，薏苡附子敗醬散組小鼠結腸組織隱窩腔較為完整，杯狀細胞明顯，炎性程度和腫瘤惡性程度低于模型組，其中高劑量組改善效果最好，表明薏苡附子敗醬散對結腸癌發生具有抑制作用。

由于炎性腸癌與炎癥反應有著密切的相關性［20-21］，本研究對小鼠血清多種炎性相關細胞因子進行檢測。IL-6 是炎癥性腸病發展過程中的一種核心促炎細胞因子，也是炎性疾病嚴重程度和預后指標的生物標記物［22-25］。IL-17 是T細胞誘導的炎癥反應的早期啟動因子，通過促進T 細胞的激活和刺激上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞產生IL-6、IL-8 等多種炎性細胞因子來放大炎性反應，促進炎癌轉化［26-28］。IL-10 是一種抗炎與免疫抑制性細胞，可以抑制多種炎性介質釋放及促炎細胞因子分泌，發揮免疫調節作用［29］。IL-2 是一種抑炎因子，具有活化T 細胞，刺激NK細胞增殖，促進B 細胞增殖和分泌抗體等作用［30］。IFN-γ具有增強巨噬細胞抗腫瘤活性功能［31］。本研究發現，薏苡附子敗醬散能降低血清促炎細胞因子IL-5、IL-6、IL-17 水平，升高抑炎因子IL-10、IL-2、IFN-γ 水平，表明薏苡附子敗醬散可以通過調節結腸癌小鼠體內炎性因子水平，減輕炎癥反應，促進機體恢復。

NF-κB 作為炎性介質激活致癌轉錄因子，在促進炎癌轉化過程中發揮關鍵作用，目前研究發現，在IBD 和CRC患者的巨噬細胞和上皮細胞中均可以檢測到活化的NF-κB，NF-κB 的活化可以促進炎癥因子釋放，而釋放的炎癥因子又可反過來促進NF-κB 活化，形成正反饋過程，導致炎癥不斷放大加深，進而惡化為腫瘤。IKB 作為NF-κB 家族的抑制因子，通過從NF-κB 復合體中解離并降解，暴露NFκB 的核定位序列，使NF-κB 發生核易位，并與特異的KB序列結合來促進NF-κB 的激活［32］。本研究發現，薏苡附子敗醬散可以降低NF-κB p65、IKBα 和p-IKBα 蛋白表達，其中高劑量組降低最為明顯，表明薏苡附子敗醬散可能通過抑制NF-κB 信號通路的激活，對結腸炎癌轉化模型小鼠結腸組織炎癥起到抑制作用。

綜上所述，薏苡附子敗醬散具有預防Aom／DSS 致結腸炎癌轉化模型小鼠腫瘤生長的作用，其機制可能是通過對炎性細胞因子水平的調節，降低NF-κB 信號通路相關蛋白表達，從而降低NF-κB 信號過度激活引起的炎癥反應，減緩炎癌轉化進程，預防結腸癌的發生。