藿香正氣方揮發油提取工藝優化及GC-MS 分析

連益純，張東元，楊 輝，段銀穎，翁澄瑩，李知瑾，林 靜，羅友華

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122； 2.廈門市醫藥研究所，福建 廈門 361008； 3.廈門市天然藥物研究與開發重點實驗室，福建 廈門 361008）

藿香正氣方源于宋《太平惠民和劑局方》，用于濕邪為患的多種病證，被歷代醫家尊為“祛濕圣藥”，用于治療胃腸道感冒、濕阻中焦等癥效果明顯［1-2］。我國約有630家藥廠生產10 種藿香正氣劑型，2020 年版《中國藥典》收載了5 種藿香正氣制劑［3］，藿香正氣水、口服液、滴丸3 種劑型的處方、比例相同（廣藿香油-紫蘇葉油＝2 ∶1，蒼術-陳皮-姜厚樸-白芷＝2 ∶2 ∶2 ∶3，干姜-生半夏＝1 ∶11.9），制法不同； 上述3 種劑型與軟膠囊的處方、比例和制法均不同。上述4 種制劑處方均用蒼術取代白術，生半夏取代半夏曲，干姜取代生姜（制法中把干姜與用冷水浸泡透心的生半夏共煎，以降低生半夏毒性），甘草浸膏取代炙甘草，廣藿香油取代廣藿香，紫蘇葉油取代紫蘇葉，刪去大棗、桔梗，與藿香正氣散差異較大； 加味藿香正氣軟膠囊與藿香正氣散基本相同［3-4］。

為更好提取藿香正氣方中揮發油，本研究以藿香正氣水處方為依據，以得率優選揮發油提取工藝，以轉移率優選3 種蒸餾工藝路線； 建立GC-MS 法比較單提和混提揮發油化學成分差異。從揮發油藥效物質基礎的角度為藿香正氣制劑二次開發和含揮發油成分的中藥制劑研究提供參考。

1 材料

Agilent 7890A-5977B 氣相色譜-質譜聯用儀（配置MSD ChemStation F.01.03.2357 數據處理系統、NIST17 標準質譜圖庫，美國安捷倫公司）； 揮發油測定器（測定管刻度5 mL，精確到0.1 mL，廈門綠茵試劑玻儀有限公司）；XS205 型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）； 水蒸氣發生器（水蒸氣溫度為室溫～150 ℃）、定制玻璃管圓柱（內徑5 cm，長度30 cm）［菁工儀器（上海）有限公司］；KQ-500VDB 型三頻數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

姜厚樸（批號20201102，產地四川，廣東匯群中藥飲片股份有限公司）、白芷（批號201101，產地四川遂寧，亳州市張仲景中藥飲片有限責任公司）、紫蘇葉、干姜（批號2006033、2012038，產地浙江，浙江華宇藥業股份有限公司）、廣藿香（批號20201101，產地廣東，廣東匯群中藥飲片股份有限公司）、陳皮（批號200401，產地浙江衢州，安徽人民中藥飲片有限公司）、蒼術 （批號210115079a，產地內蒙呼倫貝爾，安徽新盛中藥飲片有限公司）、生半夏（批號200905-04，產地甘肅，福建承天藥業有限公司）均購自國藥控股福建有限公司，經專家鑒定為正品。正己烷（批號20201021，國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 藥典法提取揮發油（外部加熱共水回流法）按藿香正氣水系列處方、制備工藝情況，把方中含揮發油的飲片按表1 分成5 種混合樣品，分別提取混合揮發油。

稱取廣藿香、紫蘇葉、姜厚樸、蒼術、陳皮、白芷、干姜、生半夏適量，分別粉碎過2 號篩得8 味飲片粗粉。按2020 年版《中國藥典》 四部2204 揮發油測定甲法，分別稱取上述粗粉各100 g 和①～⑤號樣品，分別放入2 000 mL 圓底燒瓶中，從測定器上端口加入1 000 mL 飲用水，將燒瓶放入電熱套中，接上球形回流冷凝管和水溫2～6 ℃的冷卻水，飲片（或粗粉）浸泡30 min 后開始加熱，沸騰后計時，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h 分別記錄揮發油體積，用標記好的棕色瓶收存揮發油，密封后于4 ℃冰箱冷藏備用，同法提取上述樣品揮發油2 批，計算揮發油得率和轉移率，結果見表2 ～4，公式為揮發油得率＝ ［揮發油體積／飲片（粗粉）質量］×100%、揮發油轉移率＝（混提所得揮發油體積／混提物料中所含揮發油的理論體積之和）×100%。

表2 單味飲片粗粉揮發油得率測定結果（藥典法，%，n＝3）

由表2 可知，廣藿香粉、紫蘇葉粉、蒼術粉、陳皮粉、白芷粉、姜厚樸粉、干姜粉按藥典法單獨提取揮發油的最高得率分別為1.58%、0.28%、2.15%、0.34%、0.16%、0.62%、1.51%，單獨提取的最優時間分別為5、6、5、5、3、7、5 h。生半夏粉未提取得到揮發油，說明藥典法不適用于生半夏揮發油的提取，與文獻［5］報道一致。

由表3 可知，①～⑤號樣品的揮發油最高得率分別為0.98%、0.40%、1.14%、0.81%、1.02%，最優混合提取時間分別為8、8、8、7、5 h。

表3 5 種樣品揮發油得率測定結果（藥典法，%，n＝3）

根據混提飲片（粗粉）質量和本實驗測得單味粉末揮發油得率，計算①～⑤（按干姜質量計算）號樣品的揮發油理論得率分別為 0.74%、0.74%、0.99%、0.99%、1.51%，再按“2.1” 項下揮發油轉移率公式和表3 混提揮發油最高得率分別計算其揮發油轉移率，結果見表4。由此可知，藿香正氣水處方飲片、粉末混提揮發油轉移率平均值不同，依次為①＞③＞④＞⑤＞②，說明采用藥典法提取藿香正氣方揮發油時，粗粉混提揮發油轉移率高于飲片混提。

表4 5 種樣品揮發油轉移率測定結果（藥典法，%）

2.2 通入水蒸氣加熱共水回流法提取混合飲片揮發油 分別稱取②④號樣品，放入2 000 mL 三口圓底燒瓶中，一側口用帶有溫度計的橡膠塞密封，另一側口接水蒸氣發生器，中間口接揮發油測定器，從測定器上端口加入1 000 mL 飲用水，接上球形回流冷凝管和水溫為2～6 ℃的冷卻水，飲片浸泡30 min 后，向圓底燒瓶中的藥液通入水蒸氣開始加熱，水蒸氣發生器溫度設為115 ℃，藥液沸騰（溫度為95 ℃以上）后開始計時，其余操作同 “2.1” 項。按“2.1” 項下方法再分別提取上述2 種混合飲片揮發油2 批，計算揮發油得率和轉移率，結果見表5～6。

表5 混提處方揮發油得率測定結果（通入水蒸氣加熱共水回流法，%，n＝3）

由表5 可知，藿香正氣水處方中②④號樣品通入水蒸氣加熱共水回流法揮發油最高得率分別為0.38%、0.62%；飲片混提的最優時間分別為9、7 h。

由表6 可知，藿香正氣水處方中②④號樣品混合飲片通入水蒸氣加熱共水回流法揮發油轉移率分別為50.90%、62.96%。

表6 混提處方揮發油轉移率測定結果（通入水蒸氣加熱共水回流法，%）

2.3 水蒸氣擴散法提取混合飲片揮發油 分別稱取②④號混合飲片總重50 g，放入定制的玻璃管圓柱中，用飲用水潤濕飲片后將玻璃管圓柱豎直靜置30 min，玻璃管圓柱的上進口接水蒸氣發生器，下出口接蛇形冷凝管后再接揮發油測定器，接上水溫為2～6 ℃的冷卻水，通入115 ℃水蒸氣后開始計時，其余操作同“2.1” 項。按“2.1” 項下方法再分別提取上述2 種混合飲片揮發油2 批，發現采用水蒸氣擴散裝置無法提取到②④號樣品的揮發油。

2.4 藿香正氣水處方揮發油最優提取工藝的確定 由表4、6 可知，藿香正氣水處方中②④號樣品按揮發油得率平均值的提取方法均依次為藥典法＞通入水蒸氣加熱共水回流法＞水蒸氣擴散法，所以藿香正氣水處方中②④號樣品揮發油的最優水蒸氣蒸餾法提取工藝均為粗粉回流8 h； 但因采用粗粉提取時，需先把飲片粉碎成粗粉，在水煎煮提取過程中粗粉容易發生焦糊，后續藥液過濾比飲片困難。因此，②④號樣品的最優提取工藝分別確定為飲片混提8 h、飲片混提7 h。

因半夏和干姜的粗粉在水提取過程中，均發生嚴重焦糊現象，所以⑤號樣品揮發油只能采用飲片提取。由表4可知，⑤號樣品的最優提取工藝為飲片混提5 h。

2.5 供試品溶液制備 分別吸取廣藿香油、紫蘇葉油、姜厚樸油、蒼術油、陳皮油、白芷油、干姜油及①～⑤號揮發油各15 μL 至棕色瓶中，分別用1 485 μL 正己烷稀釋并混勻，超聲（45 kHz、500 W）提取3 min，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.6 氣相色譜條件 Agilent HP-5MS 石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）； 進樣口溫度250 ℃； 載氣氦氣（質量分數99.999%）； 分流比10 ∶1； 體積流量1 mL／min； 程序升溫（初始60 ℃，以8 ℃／min 升至280 ℃，保持27.5 min）； 進樣量2 μL。

2.7 質譜條件 電子電離源，電子能量70 eV； 離子源溫度230 ℃； 四級桿150 ℃； 掃描質量范圍m／z50 ～1 500，全掃描方式； 溶劑延遲時間4 min。

2.8 GC-MS 分析 采用GC-MS 分析“2.5” 項下12 種揮發油供試品溶液，得其總離子流圖，見圖1。通過安捷倫計算機數據系統NIST17 數據庫，對各成分峰質譜數據進行檢索對照，按匹配度在70%以上初步鑒定化合物，確定了上述12 種揮發油的主要化學成分，按相對含量歸一化法計算各化合物在揮發油中的相對含量（相對百分含量），對匹配度70%、相對含量1%以上的化合物進行分析比較，結果見表7。

圖1 藿香正氣水處方12 種樣品揮發油的GC-MS總離子流圖

表7 揮發油成分相對含量（排名前5 位）

由此可知，①揮發油與②揮發油、③揮發油與④揮發油、干姜粉末揮發油和⑤揮發油排在前5 位的化合物及相對含量均不同，說明單提和混提揮發油以及原料采用粗粉還是飲片，其所得揮發油的成分種類和相對含量均發生了較大變化。

藿香正氣水處方單提和混提揮發油成分和相對含量比較可見，②揮發油與②飲片分別單提油（45 個化合物）比較，d-檸檬烯等5 個化合物相對含量發生了變化，新增1-甲基-4- （1-甲基乙基）-1，4-環己二烯等5 個化合物，減少α-桉葉醇等40 個化合物。①揮發油與①飲片分別單提油（45 個化合物）比較，β-桉葉醇等8 個化合物相對含量發生了變化，新增沉香螺萜醇等6 個化合物，減少α-桉葉醇等37 個化合物。③揮發油（22 個化合物）與③飲片分別單提油（60 個化合物）比較，百秋李醇等17 個化合物相對含量發生了變化，新增沉香螺萜醇等5 個化合物，減少α-桉葉醇等43 個化合物。④揮發油（14 個化合物）與④飲片分別單提油（60 個化合物）比較，百秋李醇等13 個化合物相對含量發生了變化，新增（1R，4aS，6R，8aS）-8a，9，9-三甲基-1，2，4a，5，6，7，8，8a-八氫-1，6-甲烷萘-1-醇1 個化合物，減少α-桉葉醇等47 個化合物。結果表明，②揮發油與②飲片分別單提油、④揮發油與④飲片分別單提油之間成分種類和相對含量也不相同。⑤揮發油（24 個化合物）與干姜粉油（9 個化合物）比較，姜烯等6個化合物相對含量發生了變化，新增4-甲基-1- （1-甲基乙基）-雙環［3.1.0］六-2-烯等18 個化合物，減少（Z）-1-甲基-4- （6-甲基庚-5-烯-2-亞基）環己-1-烯等3 個化合物，表明用干姜和半夏在一起炮制煎煮過程中，干姜揮發油成分的種類和相對含量均發生了較大變化。

3 討論

2020 年版《中國藥典》 一部收載的藿香正氣水中，廣藿香和紫蘇葉是以廣藿香油-紫蘇葉油（2 ∶1）投料，優點是很好地保證了飲片揮發油的劑量，不足的是丟失了飲片的水溶性成分，是否科學值得進一步研究［6］。

本研究發現水蒸氣擴散法無法提出藿香正氣水飲片的揮發油，可能是水分子不能充分滲透進入植物細胞油室中，導致揮發油分子無法與水乳化，無法和水蒸氣一起進入冷凝管中，故未能提取得到揮發油。藿香正氣水處方的12 種樣品揮發油得率為0.16% ～2.15%，單一成分相對含量為1.0% ～44.3%，故分析得到揮發油單一成分在原復方飲片中的含量為0.001 6% ～0.908 2%。

廣藿香的揮發油和黃酮類化合物對金色葡萄球菌、念珠菌均有抑制作用，對細菌感染的皮膚病有療效［7］。Murugan 等［8］鑒定出廣藿香油26 種成分，主要為α-愈傷木烯、塞舌爾烯、α-廣藿香烯、α-布爾烯和廣藿香醇。Xu等［9］對不同部位厚樸油分析表明，桉葉醇及其異構體（a-，c-桉葉醇）含量較高，分別為47.66%、36.74%、36.31%。Liu 等［10］分析了紫蘇梗油、紫蘇葉油和紫蘇子油成 分，發 現 1，4，7-cycloundecatriene-1、5，9，9-tetramethyl-zzz、1-環己烷-1-甲醛、β-石竹烯、2-己酰基呋喃、β-法尼烯是其主要成分。Luo 等［11］測定了我國不同產地10 個品種25 批次陳皮成分，共鑒定出98 個化合物，主要為d-檸檬烯、γ-松油烯、α-松油烯、芳樟醇和月桂烯。Shirooye 等［12］共鑒定出姜油94% 以上的成分（55 個化合物），最多的為α-姜烯（15.20%）、β-菲香烯（13.51%）、莰烯 （7.69%）、E-E-α-法尼烯 （7.04%）、β-倍半香烯（6.96%）和ar-姜黃烯 （5.60%），占揮發油的56%。Li等［13］對白芷等4 種傘形科植物揮發油分析表明，含多種鄰內酯類化合物，其中富含木本內酯、反式苯甲醚和蛇床子素，均具抗炎活性。

由于產地、采收時間、采收部位、炮制方法、提取工藝等均會影響揮發油得率和成分，本研究對藿香正氣水處方揮發油的GC-MS 分析結果與許多文獻報道的結果也不盡相同［14-21］。因此，希望藥學人員繼續積累中藥揮發油的分析數據，建立中藥揮發油GC-MS 數據庫，為中藥現代化發展奠定揮發油藥效物質研究基礎。