芪骨膠囊含藥血清對地塞米松誘導(dǎo)C2C12 細(xì)胞萎縮的保護(hù)作用

石金玉，楊宗睿，葛海雅，郭海玲，詹紅生*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院石氏傷科醫(yī)學(xué)中心，上海 200120； 2.上海市中醫(yī)藥研究院骨傷科研究所，上海 200120）

肌少癥由Rosenberg 在上世紀(jì)80 年代末首次提出，是指衰老過程中全身骨骼肌的肌量減少、肌力下降、肌肉生理功能減退，導(dǎo)致身體活動性下降的一種退行性疾?。?］。肌少癥與活動障礙、跌倒、骨質(zhì)疏松等密切相關(guān)，是老年人生理功能減退的重要原因之一，嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量，甚至縮短老年人的壽命［2-4］。目前推薦以運(yùn)動療法和營養(yǎng)療法來防治肌少癥，尚無有效的治療藥物［5］。

芪骨膠囊又名補(bǔ)腎方、補(bǔ)腎益精方、密骨膠囊，由淫羊藿、何首烏、肉蓯蓉、骨碎補(bǔ)、黃芪、石斛、菊花7 味藥組成，是全國名中醫(yī)石印玉教授結(jié)合其多年的臨證經(jīng)驗(yàn)所創(chuàng)經(jīng)驗(yàn)方，該藥已于2009 年12 月上市并獲得國家新藥證書，臨床上用于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。一項(xiàng)為期36 個月針對絕經(jīng)后期女性的隨機(jī)雙盲安慰劑對照試驗(yàn)顯示，芪骨膠囊可以提高骨密度，此外還能維持大腿瘦質(zhì)量、改善起立行走測試評分、降低跌倒風(fēng)險(xiǎn)［6］，提示芪骨膠囊具有防治肌少癥的潛力。既往動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芪骨膠囊能提高去卵巢大鼠股四頭肌肌球蛋白重鏈I （Myosin heavy chain I，MyHCI）mRNA 表達(dá)［7］及腓腸肌濕重比［8］，提示芪骨膠囊有促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成代謝的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上探討芪骨膠囊含藥血清對地塞米松誘導(dǎo)的C2C12 肌管萎縮的影響，以期為芪骨膠囊治療肌少癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物和細(xì)胞 40 只3 月齡雄性SD 大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司［實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK （滬）2018-0006］，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)間，溫度（22±2）℃，相對濕度 （50±5）%，12 h／12 h 光暗循環(huán)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)所有程序均符合國際動物福利標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)通過（倫理號PZSHUTCM200731010）。小鼠C2C12 成肌細(xì)胞購自中國科學(xué)院干細(xì)胞庫，編號SCSP-505。

1.2 藥物與試劑 芪骨膠囊 （國藥準(zhǔn)字Z20090656，廈門中藥廠有限公司）。高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清、0.25%胰酶（美國Gibco公司，貨號 C11995500BT、10099141、26050070、25200056）； 地塞米松［翌圣生物科技（上海）股份有限公司，貨號40323ES25］； Cell Counting Kit-8 （CCK8）試劑盒 （日本同仁化學(xué)公司，貨號CK04）； BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒、青霉素-鏈霉素溶液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號P0010、P0012A、P0018S、C0222）； 蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑Ⅰ／Ⅱ／Ⅲ、PI3K 抑制劑LY294002 （美國MedChemExpress 公司，貨號HYK0010、HY-K0021、HY-K0022、HY-K0023、HY-10108）； 蛋白激酶B （Akt）、磷酸化（p）-Akt、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、p-PI3K、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p-mTOR、GAPDH 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司，貨號4691、4060、4257、4228、2983、2971、2118 ）；Forkhead 轉(zhuǎn)錄因子3a （FoxO3a）、p-FoxO3a、肌肉特異性環(huán)指蛋白1 （MuRF-1）、肌肉萎縮盒F 基因（Atrogin-1）、MyHC 抗體（英國Abcam 公司，貨號ab109629、ab154786、ab172479、ab168372、ab124205）； 山羊抗兔二抗（美國Proteintech 公司，貨號SA00001-2）。

1.3 儀器 多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；倒置顯微鏡 （日本Olympus 公司）； 電泳儀、ChemiDoc MP 成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 含藥血清制備 將40 只SD 大鼠隨機(jī)分為空白組和中藥組，每組各20 只，按照人與大鼠等效劑量換算，中藥組大鼠灌胃給予0.52 g／kg 芪骨膠囊混懸液，空白組灌胃給予等量蒸餾水，每天2次，連續(xù)5 d。末次給藥1 h 后，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，4 ℃低溫靜置4 h，4 ℃、3 000 r／min 離心10 min，取上層血清，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾2 次，56 ℃水浴滅活30 min，將同組血清混合后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 C2C12 細(xì)胞培養(yǎng) 將C2C12 細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，用完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素）培養(yǎng)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，48 h 更換1 次完全培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長至80% ～90%時用胰酶消化，收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 CCK-8 法檢測C2C12 細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期C2C12 細(xì)胞，以每孔1×104個的密度接種到96孔板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，細(xì)胞貼壁后血清饑餓24 h，將細(xì)胞分為正常對照組、地塞米松組、10%空白血清組、10%芪骨膠囊含藥血清組，每組6 個復(fù)孔，各組給予相應(yīng)藥物處理48 h 后，除正常對照組外，其余各組再加入10 μmol／L 地塞米松繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用PBS 洗2 次，每孔中加入10 μL CCK-8 溶液，在培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm 波長處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活力。

2.4 C2C12 細(xì)胞分化及干預(yù) 將C2C12 細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時改用分化培養(yǎng)基（含2% 馬血清和1%青霉素-鏈霉素）誘導(dǎo)細(xì)胞分化，每48 h 更換1 次培養(yǎng)基，分化6 ～7 d，待肌管細(xì)胞形成，按照“2.3” 項(xiàng)下方法分組處理肌管細(xì)胞，另設(shè)置PI3K抑制劑LY294002 組（25 μmol／L LY294002 ＋10%芪骨膠囊含藥血清＋地塞米松），LY294002 提前1 h干預(yù)細(xì)胞。

2.5 C2C12 肌管直徑測量 肌管直徑測量方法參考文獻(xiàn)［9-10］報(bào)道，使用倒置顯微鏡對C2C12肌管細(xì)胞進(jìn)行觀察、拍攝，每組隨機(jī)選取4 個視野，以每個成熟肌管中部2／3 作為其直徑測量部位，每條肌管沿3 個不同短軸方向測量，3 次測量的平均值為肌管直徑。

2.6 Western blot 法檢測細(xì)胞MyHC、MuRF-1、Atrogin-1 及PI3K／Akt 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá) 各組C2C12 肌管細(xì)胞用4 ℃預(yù)冷的PBS 洗2 次，加入含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液提取總蛋白，4 ℃、12 000 r／min 離心10 min，BCA 法測定總蛋白濃度，蛋白通過SDS-PAGE 凝膠分離，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，室溫封閉1 h 后，將膜與相應(yīng)的一抗在4 ℃孵育過夜，次日加二抗于室溫下孵育1 h，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯影，使用ChemiDoc MP 成像系統(tǒng)對特異性蛋白條帶進(jìn)行成像，并分析目的蛋白表達(dá)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 24.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 芪骨膠囊含藥血清對C2C12 細(xì)胞活力的影響 如圖1 所示，與正常對照組比較，地塞米松組和空白血清組C2C12 細(xì)胞活力降低（P＜0.01）；與地塞米松組和空白血清組比較，芪骨膠囊含藥血清組細(xì)胞活力增強(qiáng)（P＜0.01），提示芪骨膠囊含藥血清對地塞米松誘導(dǎo)的C2C12 成肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

圖1 芪骨膠囊含藥血清對C2C12 細(xì)胞活力的影響（±s，n＝6）Fig.1 Effects of Qigu Capsule-medicated serum on the viability of C2C12 cells （±s，n＝6）

3.2 芪骨膠囊含藥血清對C2C12 肌管細(xì)胞直徑的影響 如圖2 所示，與正常對照組比較，地塞米松組和空白血清組肌管直徑縮短（P＜0.01）； 與地塞米松組和空白血清組比較，芪骨膠囊含藥血清組肌管直徑增長（P＜0.01），提示芪骨膠囊含藥血清可以緩解地塞米松誘導(dǎo)的C2C12 肌管細(xì)胞萎縮。

圖2 芪骨膠囊含藥血清對C2C12 肌管細(xì)胞直徑的影響（x±s，n＝3）Fig.2 Effects of Qigu Capsule-medicated serum on the diameter of C2C12 myotubes （x±s，n＝3）

3.3 芪骨膠囊含藥血清對C2C12 肌管細(xì)胞萎縮相關(guān)蛋白及MyHC 蛋白表達(dá)的影響 如圖3 所示，與正常對照組比較，地塞米松組和空白血清組C2C12肌管細(xì)胞MyHC 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），萎縮相關(guān)蛋白MuRF-1、Atrogin-1 表達(dá)升高（P＜0.01）；與地塞米松組和空白血清組比較，芪骨膠囊含藥血清組MyHC 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），MuRF-1、Atrogin-1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）。

圖3 芪骨膠囊含藥血清對C2C12 肌管細(xì)胞MyHC、MuRF-1、Atrogin-1 蛋白表達(dá)的影響（x±s，n＝3）Fig.3 Effects of Qigu Capsule-medicated serum on the protein expressions of MyHC，MuRF-1 and Atrogin-1 in C2C12 myotubes （x±s，n＝3）

3.4 芪骨膠囊含藥血清對C2C12 肌管細(xì)胞PI3K／Akt 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖4 所示，與正常對照組比較，地塞米松組和空白血清組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-FoxO3a 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.01）； 與地塞米松組和空白血清組比較，芪骨膠囊含藥血清組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-FoxO3a 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01），提示芪骨膠囊含藥血清可緩解地塞米松誘導(dǎo)的C2C12肌管萎縮作用，且可能與激活PI3K／Akt 信號通路相關(guān)。

3.5 LY294002 作用下芪骨膠囊含藥血清對C2C12肌管細(xì)胞直徑的影響 如圖5 所示，與芪骨膠囊含藥血清組比較，加入PI3K 抑制劑LY294002 后，C2C12 肌管細(xì)胞直徑降低（P＜0.01），提示芪骨膠囊含藥血清誘導(dǎo)肌管肥大的作用被減弱。

圖5 LY294002 作用下芪骨膠囊含藥血清對C2C12 肌管細(xì)胞直徑的影響（x±s，n＝3）Fig.5 Effects of Qigu Capsule-medicated serum on the diameter of C2C12 myotubes in presence of LY294002 （x±s，n＝3）

3.6 LY294002 作用下芪骨膠囊含藥血清對C2C12肌管細(xì)胞萎縮蛋白表達(dá)的影響 如圖6 所示，與芪骨膠囊含藥血清組比較，加入LY294002 后，細(xì)胞MuRF-1、Atrogin-1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）。

圖6 LY294002 作用下芪骨膠囊含藥血清對C2C12 肌管細(xì)胞MuRF-1、Atrogin-1 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）Fig.6 Effects of Qigu Capsule-medicated serum on the protein expressions of MuRF-1 and Atrogin-1 in C2C12 myotubes in presence of LY294002 （±s，n＝3）

3.7 LY294002 作用下芪骨膠囊含藥血清對C2C12肌管細(xì)胞PI3K／Akt 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖7 所示，與芪骨膠囊含藥血清組比較，LY294002 干預(yù)后，細(xì)胞 PI3K、Akt、mTOR、FoxO3a 的磷酸化水平均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖7 LY294002 作用下芪骨膠囊含藥血清對C2C12 肌管細(xì)胞PI3K／Akt 信號通路蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）Fig.7 Effects of Qigu Capsule-medicated serum on the expressions of of PI3K／Akt signaling pathwayrelated proteins in C2C12 myotubes in presence of LY294002 （±s，n＝3）

4 討論

2018 年歐洲肌少癥工作組更新共識強(qiáng)調(diào)低肌力是肌少癥的關(guān)鍵特征［11］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，50 ～60 歲每年肌力下降約1.5%，60 歲之后每年下降3%［12］。肌肉力量隨增齡而下降，與《黃帝內(nèi)經(jīng)》 中“筋”的功能隨年齡增長而減退很相似，從“筋骨勁強(qiáng)”“筋骨隆盛” 發(fā)展至“筋不能動”，乃至“筋骨解墮”。上海著名骨傷科流派-石氏傷科認(rèn)為“筋” 是具有一定生物力學(xué)性能的纖維組織［13］，力是“筋”的主要功能。中醫(yī)經(jīng)典理論認(rèn)為，肝主筋，與全身運(yùn)動有關(guān)，可以通過補(bǔ)益肝腎，達(dá)到強(qiáng)筋健骨的目的。芪骨膠囊具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的功效，先前的研究也提示芪骨膠囊具有抗肌少癥的潛力［6］。

骨骼肌在衰老過程中蛋白質(zhì)合成速率降低，降解速率增加，導(dǎo)致肌纖維萎縮，肌力下降，肌肉生理功能減退［14］。骨骼肌蛋白質(zhì)合成主要受P13K／Akt 信號通路調(diào)控，在肌肉萎縮過程中PI3K／Akt信號通路活性下降，而激活這條通路可以降低增齡所致的肌肉萎縮程度［15］。而FoxO3a 是FoxO 家族成員之一，主要參與骨骼肌蛋白質(zhì)的降解。MuRF-1 和Atrogin-1 是骨骼肌萎縮的標(biāo)志性蛋白，它們在多種骨骼肌萎縮疾病中升高［16-18］。已有研究證明FoxO的轉(zhuǎn)錄活性是MuRF-1 和Atrogin-1 上調(diào)所必需的，說明激活FoxO 足以誘發(fā)骨骼肌萎縮［19-20］。FoxO 的活性與其磷酸化狀態(tài)直接相關(guān)，F(xiàn)oxO 可被Akt 磷酸化失活，而在去磷酸化時發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性［21-22］。

C2C12 成肌細(xì)胞被廣泛用于體外研究骨骼肌的萎縮，本研究使用10 μmol／L 地塞米松建立體外肌萎縮模型［23-24］。結(jié)果顯示，芪骨膠囊含藥血清能夠保護(hù)地塞米松誘導(dǎo)的C2C12 細(xì)胞損傷，減輕地塞米松誘導(dǎo)的肌管萎縮，并增加了MyHC 的表達(dá)。MyHC 是肌管的主要結(jié)構(gòu)蛋白，本研究發(fā)現(xiàn)芪骨膠囊含藥血清誘導(dǎo)的肌管肥大與MyHC 的增加相關(guān)。此外，本研究還觀察了芪骨膠囊含藥血清對MuRF-1、Atrogin-1 以及PI3K／Akt 信號通路的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)芪骨膠囊含藥血清增加了PI3K、Akt 和mTOR 的磷酸化水平，提示芪骨膠囊可以通過激活PI3K／Akt／mTOR 信號通路來促進(jìn)蛋白合成。同時，Akt的另一個重要功能是通過磷酸化FoxO 而抑制MuRF-1 和Atrogin-1 的表達(dá)［21-22］。本研究結(jié)果顯示，芪骨膠囊增加了FoxO3a 磷酸化水平，并抑制了MuRF-1 和Atrogin-1 的表達(dá)。以上結(jié)果表明，芪骨膠囊可能同時參與了蛋白質(zhì)的合成和降解2 個過程，從而發(fā)揮抗肌管萎縮的作用。為了驗(yàn)證芪骨膠囊是否通過PI3K／Akt 依賴性的方式促進(jìn)肌管肥大，本研究應(yīng)用PI3K 抑制劑LY294002 預(yù)處理細(xì)胞，結(jié)果顯示LY294002 消除了芪骨膠囊誘導(dǎo)的肌管肥大作用，增加了MuRF-1 和Atrogin-1 的表達(dá)，并抑制了PI3K、Akt、mTOR 及FoxO3a 的磷酸化水平。

綜上所述，芪骨膠囊一方面通過PI3K／Akt 途徑激活mTOR，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，另一方面通過Akt 磷酸化FoxO3a 而抑制MuRF-1、Atrogin-1 的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗肌管萎縮的作用。