強(qiáng)心合劑HPLC 指紋圖譜建立及11 種成分測(cè)定

高紫薇，吳 磊，林欣榮，陳曉虎*，蒲維婭*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210029）

強(qiáng)心合劑是江蘇省中醫(yī)院醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，由國(guó)醫(yī)大師唐蜀華教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)研制而成［1］，在心內(nèi)科應(yīng)用多年，由炙黃芪、淡附片、黨參、丹參、車前草、玉竹、葶藶子、麥冬8 味中藥組成［2］，方中黃芪益氣升陽(yáng)，與附子合為君藥，共治心衰“虛” 之本； 黨參助君藥補(bǔ)氣功效，丹參涼血活血，消其苦寒之弊，而葶藶子、車前草利水通淋，四者共為臣藥； 佐以麥冬、玉竹養(yǎng)陰生津，陰中求陽(yáng)［3］，全方具有加強(qiáng)心肌收縮力、改善舒張功能、減慢心率等作用，主要用于慢性心衰等疾病的治療［4］。指紋圖譜能反映中藥復(fù)方整體化學(xué)信息，使其所含活性成分更直觀地呈現(xiàn)出來(lái)，從而控制其整體質(zhì)量［5］。本實(shí)驗(yàn)建立強(qiáng)心合劑HPLC 指紋圖譜，并同時(shí)測(cè)定槲皮素-3-O-β-D葡萄糖7-Oβ-D龍膽雙糖苷（QGG）、芥子堿硫氰酸鹽、芥子酸、大車前苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、車前草苷D、毛蕊異黃酮、黃芩素、芒刺柄花素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、甲基麥冬二氫高異黃酮B 的含量，以期為該方質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 安捷倫1260 型高效液相色譜儀，配置DAD 檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）； BP-211D 型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）； KQ-1000E 型醫(yī)用超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）； SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 槲皮素-3-O-β-D葡萄糖7-O-β-D龍膽雙糖苷（QGG）、芥子堿硫氰酸鹽、大車前苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芩素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)220414、220108、220425、220509、220905、220324）； 芥子酸、車前草苷D、毛蕊異黃酮、芒刺柄花素、甲基麥冬二氫高異黃酮B 對(duì)照品（江北新區(qū)雙木實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)科技中心，批號(hào) 220117、220514、220405、220314、220609）。強(qiáng)心合劑共15 批，編號(hào)S1 ～S15，批號(hào)20220119、20220130、20220213、20220227、20220310、20220325、20220407、20220418、20220503、20220522），均由江蘇省中醫(yī)院制劑部提供； 各單味藥水煎煮液及其陰性制劑均由實(shí)驗(yàn)室按制劑工藝制備。8 味飲片經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部專家鑒定為正品，具體見(jiàn)表1。甲醇、乙腈、磷酸為色譜純； 其余試劑均為分析純； 水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A）-0.01 mol／L 磷酸（B），梯度洗脫（0 ～5 min，2% ～5%A； 5～25 min，5% ～15%A； 25～70 min，15% ～25%A； 70 ～80 min，25% ～40% A； 80 ～90 min，40% ～60% A； 90 ～110 min，60% A）； 體積流量1.0 mL／min； 柱溫40 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 稱取各對(duì)照品適量，甲醇制成分別含QGG 0.529 mg／mL、芥子堿硫氰酸鹽0.022 mg／mL、芥子酸0.005 mg／mL、大車前苷0.041 mg／mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷 0.050 mg／mL、車前草苷D 0.095 mg／mL、毛蕊異黃酮0.017 mg／mL、黃芩素0.010 mg／mL、芒刺柄花素0.005 mg／mL、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ0.011 mg／mL、甲基麥冬二氫高異黃酮B 0.002 mg／mL 的溶液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密量取本品2 mL，加入甲醇2 mL，超聲（200 W、40 kHz）處理20 min，取出，靜置至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，5 000 r／min離心3 min，吸取上清液，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 強(qiáng)心合劑制備 按單日處方劑量稱取炙黃芪、淡附片、黨參、丹參、車前草、玉竹、葶藶子、麥冬共130 g，其中淡附片加10 倍量水先煎15 min，再將藥渣和藥液與其余7 味飲片合并加到罐中，一煎加5 倍量水浸泡60 min 后煎煮50 min，二煎加4 倍量水煎煮40 min，合并濾液。

2.2.4 單味飲片、陰性樣品溶液 按“2.2.3”項(xiàng)下制備工藝制備炙黃芪、淡附片、黨參、丹參、車前草、玉竹、葶藶子、麥冬提取液及相關(guān)陰性樣品，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 HPLC 指紋圖譜建立

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取本品 （S1）適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷（7 號(hào)峰）為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD 均小于2.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品 （S1）適量，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷（7 號(hào)峰）為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD 均小于2.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品（S1）適量，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷（7 號(hào)峰）為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD 均小于2.7%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 圖譜生成 取15 批樣品（S1 ～S15），按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”，以S1 為參照，采用平均數(shù)法，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.1 min，進(jìn)行多點(diǎn)矯正、Mark 峰匹配，生成HPLC 指紋圖譜、對(duì)照?qǐng)D譜（R），共標(biāo)定20 個(gè)共有峰，見(jiàn)圖1。

圖1 15 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints for fifteen batches of samples

2.3.5 共有峰指認(rèn)及歸屬 將對(duì)照指紋圖譜與對(duì)照品保留時(shí)間、紫外吸收光譜進(jìn)行比對(duì)，共指認(rèn)出11 種成分，分別為3 號(hào)峰QGG、4 號(hào)峰芥子堿硫氰酸鹽、5 號(hào)峰芥子酸、6 號(hào)峰大車前苷、7 號(hào)峰毛蕊異黃酮葡萄糖苷、8 號(hào)峰車前草苷D、13 號(hào)峰毛蕊異黃酮、17 號(hào)峰黃芩素、18 號(hào)峰芒刺柄花素、19 號(hào)峰白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、20 號(hào)峰甲基麥冬二氫高異黃酮B，其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷分離度較好，峰面積較大，保留時(shí)間適中，峰形穩(wěn)定，并且在所有樣品中均存在，故選擇其作為參照峰（S），見(jiàn)圖2。

圖2 各成分HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of various constituents

將單味藥材及對(duì)應(yīng)陰性樣品圖譜與樣品圖譜進(jìn)行比對(duì)，共發(fā)現(xiàn)20 個(gè)共有峰，見(jiàn)圖3。其中，峰7（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、峰13 （毛蕊異黃酮）、峰18 （芒刺柄花素）歸屬于黃芪，峰19 （白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ）歸屬于黨參，峰1～2、10～12、15 ～16 歸屬于丹參，峰6 （大車前苷）、峰8 （車前草苷D）、峰17 （黃芩素）歸屬于車前草，峰20 （甲基麥冬二氫高異黃酮B）歸屬于麥冬，峰3 （QGG）、峰4（芥子堿硫氰酸鹽）、峰5 （芥子酸）、峰14 歸屬于葶藶子，峰9 是丹參、車前草共有成分。

圖3 強(qiáng)心合劑特征峰歸屬Fig.3 Characteristic peak attribution of Qiangxin Mixture

2.3.6 相似度分析 將15 批樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行比較，計(jì)算相似度，結(jié)果見(jiàn)表2。由此可知，不同批次樣品質(zhì)量均一穩(wěn)定，并且所建立的指紋圖譜可反映其指紋特征。

表2 15 批樣品相似度Tab.2 Similarities of fifteen batches of samples

2.3.7 聚類分析 通過(guò)SPSS 26.0 軟件對(duì)15 批樣品進(jìn)行聚類分析，以20 個(gè)共有峰峰面積為變量，平方歐式距離為測(cè)量尺度，結(jié)果見(jiàn)圖4。由此可知，當(dāng)類間距離小于10 時(shí)，各批樣品可分為2 類，S2～S4、S8 ～S10、S13 ～S14 為第Ⅰ類，其他批次為第Ⅱ類，表明不同批次樣品中各成分含量存在差異，可能與飲片產(chǎn)地、廠家、批次等因素有關(guān)，故保持其來(lái)源穩(wěn)定性對(duì)強(qiáng)心合劑質(zhì)量控制具有重要意義。

圖4 15 批樣品聚類分析樹(shù)狀圖Fig.4 Cluster analysis dendrogram of fifteen batches of samples

2.3.8 偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）以20 個(gè)共有峰峰面積為變量，采用SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行PLS-DA 分析，得分圖見(jiàn)圖5。由此可知，對(duì)X、Y的累積解釋能力參數(shù)分別為0.735、0.989，預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2為0.944，均大于0.7，表明模型穩(wěn)定可靠，預(yù)測(cè)能力強(qiáng)，可用于區(qū)分不同批次樣品。

圖5 PLS-DA 得分圖Fig.5 Score plot for PLS-DA

變量重要性投影（VIP）是基于偏最小二乘回歸的一種變量篩選方法［6］，可用于評(píng)估各共有峰對(duì)應(yīng)主成分對(duì)樣本分類判別的解釋能力，結(jié)果見(jiàn)圖6。由此可知，各批樣品數(shù)據(jù)均落在95%置信區(qū)間內(nèi)，主要分為2 類，S2 ～S4、S8 ～S10、S13 ～S14為一類，其他批次為一類，與聚類分析結(jié)果一致。再以VIP 值＞1 為標(biāo)準(zhǔn)篩選主要標(biāo)志性成分，發(fā)現(xiàn)有12 個(gè)共有峰符合要求，分別為4 號(hào)峰（芥子堿硫氰酸鹽）、7 號(hào)峰（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、6 號(hào)峰（大車前苷）、5 號(hào)峰（芥子酸）、1 號(hào)峰（未知）、11 號(hào)峰（未知）、12 號(hào)峰（未知）、2 號(hào)峰（未知）、10 號(hào)峰（未知）、9 號(hào)峰（未知）、13 號(hào)峰（毛蕊異黃酮）、14 號(hào)峰（未知）。

2.4 各成分含量測(cè)定

2.4.1 線性關(guān)系考察 取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，甲醇逐級(jí)稀釋，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2” 項(xiàng)下供試品溶液（S1）適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得QGG、芥子堿硫氰酸鹽、芥子酸、大車前苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、車前草苷D、毛蕊異黃酮、黃芩素、芒刺柄花素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、甲基麥冬二氫高異黃酮B 峰面積RSD 分別為1.7%、1.4%、2.5%、2.4%、2.4%、1.2%、1.1%、1.0%、1.3%、1.2%、1.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品 （S1）6 份，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得QGG、芥子堿硫氰酸鹽、芥子酸、大車前苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、車前草苷D、毛蕊異黃酮、黃芩素、芒刺柄花素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、甲基麥冬二氫高異黃酮B 含量RSD 分別為2.3%、1.2%、2.8%、0.9%、1.2%、0.9%、1.7%、1.2%、1.8%、1.9%、2.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2” 項(xiàng)下供試品溶液（S1）適量，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得QGG、芥子堿硫氰酸鹽、芥子酸、大車前苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、車前草苷D、毛蕊異黃酮、黃芩素、芒刺柄花素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、甲基麥冬二氫高異黃酮B 峰面積RSD 分別為0.6%、1.4%、2.4%、2.9%、1.0%、1.8%、1.2%、2.0%、2.7%、2.8%、0.8%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的本品6 份，精密加入對(duì)照品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，QGG、芥子堿硫氰酸鹽、芥子酸、大車前苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、車前草苷D、毛蕊異黃酮、黃芩素、芒刺柄花素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、甲基麥冬二氫高異黃酮B 平均加樣回收率分別為101.52%、98.47%、101.56%、101.09%、102.85%、100.68%、99.81%、101.41%、101.22%、100.89%、99.58%，RSD 分別為1.05%、1.25%、1.11%、1.51%、0.76%、1.16%、1.29%、0.87%、1.39%、0.48%、1.74%。

2.4.6 樣品含量測(cè)定 取 15 批樣品，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各成分含量測(cè)定結(jié)果（μg／mL）Tab.4 Results of content determination of various constituents （μg／mL）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)切換不同檢測(cè)波長(zhǎng) （205、230、260、280、310 nm）發(fā)現(xiàn)，11 種成分在230 nm 左右處均有較好吸收，并且強(qiáng)心合劑在該波長(zhǎng)下信息豐富。另外，柱溫對(duì)芥子酸、大車前苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷分離度均有影響，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同柱溫（30、40 ℃）進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)40 ℃時(shí)各成分目標(biāo)峰與其他色譜峰的分離情況均較理想。最終，選擇230 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)，40 ℃作為柱溫。

強(qiáng)心合劑按照傳統(tǒng)工藝進(jìn)行制備時(shí)，所煎煮出的成分大多能溶于水，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)水溶性成分進(jìn)行研究，包括毛蕊異黃酮、黨參炔苷、苯甲酰烏頭原堿、丹酚酸B 等20 種［7-20］，最終鑒定出11 種，分別為QGG、芥子堿硫氰酸鹽、芥子酸、大車前苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、車前草苷D、毛蕊異黃酮、黃芩素、芒刺柄花素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、甲基麥冬二氫高異黃酮B，故將其作為指標(biāo)成分。

然后，建立了15 批強(qiáng)心合劑HPLC 指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)有20 個(gè)共有峰，鑒定出11 個(gè)。相似度分析結(jié)果表明，不同批次樣品之間存在一些差異，但均大于0.93，表明其質(zhì)量較穩(wěn)定。根據(jù)聚類分析、PLS-DA 分析結(jié)果，可將各批樣品大致分為2 類，其中導(dǎo)致批次差異的成分有12 種，鑒定出5 種，分別為毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芥子酸、芥子堿硫氰酸鹽、大車前苷，故今后在生產(chǎn)工藝中可通過(guò)嚴(yán)格控制其含量來(lái)監(jiān)管全方質(zhì)量，從而使后者更穩(wěn)定安全。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立強(qiáng)心合劑HPLC 指紋圖譜，并同時(shí)測(cè)定QGG、芥子堿硫氰酸鹽、芥子酸、大車前苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、車前草苷D、毛蕊異黃酮、黃芩素、芒刺柄花素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、甲基麥冬二氫高異黃酮B 的含量，該方法穩(wěn)定可靠，可較全面地反映該方質(zhì)量，從而為其質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。