基于UHPLC-Q-Orbitrap／MS 的不同產地西洋參皂苷類成分分析

梁力文，郭 娜，劉小康，黃 鑫，蔡廣知，郭云龍*，貢濟宇*

（1.長春中醫藥大學藥學院，吉林 長春 130117； 2.長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院，吉林 長春 130117）

西洋參為五加科人參屬植物西洋參Panax quinquefoliumL.的干燥根［1-2］，又名美國參、洋參、花旗參等，具有補氣養陰、清熱生津的功效［3-5］，其主要含有皂苷類成分，在抗腫瘤、抗炎、降血壓、降血脂、抗腫瘤等方面發揮重要作用［6-11］。

西洋參原產于加拿大安大略、美國威斯康辛州，我國自上世紀80 年代引種西洋參［12-14］。目前已經形成吉林、遼寧、黑龍江、山東等主產區，由于氣候、海拔、溫度等其他因素的影響，來自不同產區的西洋參品質有差異，地理來源影響了西洋參中皂苷類成分的含量［15-18］。HPLC 法、FT-IR 法用于皂苷類成分鑒定［19-21］。然而，這些方法測定皂苷數量有限，液質聯用可以實現高通量的數據采集，并實現全面的數據挖掘彌補了前者的不足，近年來已廣泛應用于中藥復雜系統的研究。

本研究基于UHPLC-Q-Orbitrap／MS 技術結合主成分分析、正交偏最小二乘法對吉林、山東、黑龍江、遼寧產西洋參中皂苷類成分進行分析，以期為不同產地西洋參的質量評價提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器 Ultimate 3000 超高效液相色譜、QOrbitrap-MS／MS 儀 （美國Thermo Fisher Scientific公司）； AB135-S 型十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； KQ-500E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 人參皂苷Rb3、Re、Rg1、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rd 及擬人參皂苷F11對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號B21052、B21055、B21057、B21050、B21058、B21053、B21051、B21054、B20902，純度均大于98%）。乙腈、磷酸（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific 公司）； 甲醇（色譜純，美國Tedia 公司）； 水為超純水。西洋參來源于4 個不同產區，分別為吉林集安、山東威海、黑龍江綏化、遼寧新賓各10 批，共40 批樣品，經長春中醫藥大學蔡廣知副教授鑒定為五加科植物西洋參PanaxquinquefoliumL.的干燥根。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 取西洋參粉末（過3 號篩）0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入5 mL 70%甲醇，密封，稱定質量，超聲提取45 min，放冷，再次稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取人參皂苷Rb3、Re、Rg1、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rd 及擬人參皂苷F11對照品適量，加70%甲醇定容至5 mL 量瓶中，即得。

2.3 色譜條件 Supelco C18色譜柱（3.0 mm×50 mm，2.7 μm）； 流動相乙腈 （A）-0.1% 甲酸水（B），梯度洗脫（0 ～2 min，15% A； 2 ～15 min，15% ～30% A； 15 ～25 min，30% ～95% A； 25 ～27 min，95% ～15%A； 27 ～35 min，15%A）； 體積流量0.5 mL／min； 柱溫35 ℃； 進樣量5 μL。

2.4 質譜條件 電噴霧電離源（ESI）； 負離子模式； 鞘氣體積流量35 arb； 輔助氣體積流量10 arb；毛細管電壓-3.5 kV； 毛細管溫度350 ℃； 掃描范圍m／z150～2 000。

2.5 數據采集及分析 按“2.1” “2.2” 項下方法制備供試品、對照品溶液，在“2.3” “2.4” 項條件下進樣測定，得到總離子流圖。通過Sieve 軟件進行數據預處理，包括去噪、峰提取、峰對齊、峰識別和歸一化等。將處理后的數據導入SIMCA 14.0 軟件，進行無監督的主成分分析和有監督的正交偏最小二乘法判別分析，根據VIP ＞1 及P＜0.05尋找差異皂苷，并用GraphPad Prism 9 軟件對不同產地的皂苷類成分的相對含量進行比較。

3 結果

3.1 不同產地西洋參皂苷類成分鑒定 共得到62個皂苷類化合物。圖1 顯示了不同產地西洋參在負離子模式下的基峰色譜圖。所鑒定化合物的詳細信息見表1。

表1 不同產地西洋參皂苷類成分Tab.1 Saponins of Panacis Quinquefolii Radix from different origins

圖1 不同產地西洋參在負離子模式下的基峰色譜圖Fig.1 Basal peak chromatograms of Panacis Quinquefolii Radix from different origins in negative ion model

3.2 主成分分析（PCA）由圖2 可知，QC 樣本聚集保證實驗的系統穩定性。4 組樣本完全分離，每組樣本較為集中的聚集為1 類，說明組內重復性較好，存在較好的區分度。遼寧、吉林、黑龍江樣本最為接近，表明3 地西洋參所含成分最為相似，說明地理位置相近的產地采集的樣本成分具有相似性。山東樣本與其他產地樣本相距均較遠，表明山東樣本化學成分與其他產地樣本差異顯著。

圖2 不同產地西洋參PCA 得分圖Fig.2 PCA score plot of Panacis Quinquefolii Radix from different origins

3.3 正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）共得到6 組結果。由圖3 可知，每組2 個產地樣本相距較遠，分布在左右兩側，無任何重疊現象，差異明顯。山東與吉林、山東與遼寧、山東與黑龍江、遼寧與黑龍江、遼寧與吉林、黑龍江與吉林的OPLS-DA 模型解釋程度參數R2Y分別為0.999、0.995、0.994、0.998、0.999、0.999，預測能力參數Q2分別為0.988、0.981、0.981、0.911、0.88、0.956，數據表明模型解釋度和預測度良好。

圖3 不同產地西洋參OPLS-DA 得分圖及S-plotFig.3 OPLS-DA sore plot and S-plot of Panacis Quinquefolii Radix from different origins

3.4 差異成分分析 根據VIP＞1，P＜0.05 篩選并鑒定得到28 個不同產地西洋參差異皂苷類化合物，包括原人參二醇型13 個、原人參三醇型6 個、齊墩果烷型4 個、奧克梯隆型2 個、C-17 側鏈變異型3 個。

3.4.1 原人參二醇型 共鑒定得到原人參二醇型皂苷13 個，見圖4。4 個產地中丙二酰人參皂苷Rb1、丙二酰人參皂苷Rc、丙二酰人參皂苷Rd，人參皂苷Rb1含量均較高。吉林、黑龍江、遼寧的珠子參苷F5含量相近，且明顯低于山東產地。5種差異成分在山東產西洋參中含量最高，分別為人參皂苷Rc，人參皂苷Rb3、西洋參皂苷Ⅰ、20（S）-人參皂苷Rg3、20 （R）-人參皂苷Rg3。西洋參皂苷Ⅲ在山東產西洋參中含量遠低于其他產地，吉林產西洋參越南人參皂苷R4及丙二酰人參皂苷Rb2含量較高。綜上所述，原人參二醇型皂苷在4 個產地中的含量由高到低依次為遼寧、吉林、黑龍江、山東。

3.4.2 原人參三醇型 原人參二醇型和原人參三醇型皆是西洋參主要皂苷類型，共鑒定得到原人參三醇型皂苷6 個，見圖5。山東產西洋參人參皂苷Re 含量低于其他產地。山東產西洋參野三七皂苷E 含量遠高于其他產地，可作為山東產地的標志性成分。吉林產西洋參三七皂苷R1含量最高。3 種差異成分在遼寧產西洋參中含量最高，分別為人參皂苷Rg1、丙二酰人參皂苷Re、20 （S）-人參皂苷Rg2。綜上所述，原人參三醇型皂苷在4 個產地中的含量由高到低依次為遼寧、吉林、黑龍江、山東。

圖5 不同產地西洋參原人參三醇型皂苷含量柱形圖Fig.5 Histogram of protopanaxatriol-type saponin content of Panacis Quinquefolii Radix from different origins

3.4.3 其他 4 個產地西洋參樣品中鑒定出差異皂苷類化合物，齊墩果烷型4 個，分別為人參皂苷Ro、屏邊三七皂苷R2、竹節人參皂苷Ⅳ、竹節人參皂苷Ⅱ； 奧克梯隆型2 個，分別為越南人參皂苷R1、24 （R）-擬人參皂苷F11； C-17 側鏈變異型3個，分別為西洋參皂苷L11、人參皂苷Rk1、人參皂苷Rg5，見圖6。在4 個產地中，C-17 側鏈變異型皂苷含量遠低于其他類型皂苷，吉林和黑龍江產西洋參的齊墩果烷型皂苷含量相近且較高。在奧克梯隆型皂苷中，山東產西洋參越南人參皂苷R1含量最高，遼寧產西洋參24 （R）-擬人參皂苷F11含量最高。綜上所述，山東、吉林、遼寧、黑龍江地區西洋參皂苷存在一定差異，地理位置，環境條件的不同可能是導致差異的主要原因。

圖6 不同產地西洋參齊墩果烷型、奧克梯隆型、C-17 側鏈變異型皂苷含量柱形圖Fig.6 Histogram of oleanolane-type，oxytetracycline-type and C-17 side chain variant saponin content of Panacis Quinquefolii Radix from different origins

4 討論

西洋參作為名貴中藥材，近年來市場需求增大。目前，國內西洋參主產于東北及華東地區。西洋參種植由山東、吉林等傳統產地大規模向新產區擴展，其盲目引種及擴大產區，致使藥材的質量下降，因此，建立一種快速區分不同產地西洋參的方法對其質量控制具有重要意義。

本研究通過UHPLC-Q-Orbitrap／MS 技術，并結合統計學方法對不同產地西洋參進行分析，4 個不同產地西洋參有很好的分離度，表明不同產地可引起西洋參相關成分發生顯著變化。為了消除組內差異的影響，采用OPLS-DA 對山東、吉林、黑龍江、遼寧產的西洋參兩兩組合分別進行分析，結果表明所分析的數據沒有過度擬合。研究發現4 個產地樣本之間主要代謝物人參皂苷類成分存在差異，各產地西洋參皂苷類成分種類相近但含量有所不同，遼寧產西洋參皂苷含量較為突出。OPLS-DA 篩選得到28 個差異化合物，包括原人參二醇型13 個、原人參三醇型6 個、齊墩果烷型4 個、奧克梯隆型2個、C-17 側鏈變異型3 個，原人參二醇型和原人參三醇型皂苷在4 個產地相對含量由高到低依次為遼寧、吉林、黑龍江、山東。主要差異性成分的表征可為不同產地西洋參差異研究提供基礎。本研究只收集了4 個產地的西洋參樣品，但還未收集到市面上所有產地的西洋參樣品，在西洋參產地后續的研究中，可以考慮盡可能的收集更多產地的西洋參。使覆蓋面更廣，以期早日建立涵蓋所有西洋參產地的差異性皂苷數據庫。

綜上所述，本研究揭示了國內主要西洋參產地中皂苷成分的差異性，為西洋參不同產地鑒別、應用及質量評價提供理論依據。