葫蘆素B 納米混懸劑制備及其體內藥動學研究

陳 容，田 莉，薛曉菲，潘思影，楊 雪，田 青

（1.鄭州澍青醫學高等專科學校，河南 鄭州 450064； 2.新鄉醫學院，河南 新鄉 453002）

葫蘆素B 是從葫蘆科植物中提取出的一種四環三萜類化合物，具有抗炎、降血糖、保肝、抗腫瘤等活性［1-3］，對卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌等婦科疾病也具有較強治療作用［4-6］，有著開發成婦科新藥的潛力，但該成分溶解度僅為44.68 μg／mL，嚴重影響藥物溶出速率、溶出度； 油水分配系數logP為2.46［7］，表明其脂溶性較高，暫未見首關效應報道，然而生物利用度不足5%［8］，故提高其溶解度、溶出速率、溶出度是改善口服吸收的關鍵，從而有利于臨床推廣。目前，已有葫蘆素B 固體分散體［8］、磷脂復合物［9］、納米結構脂質載體［10］、自微乳等［11］報道，但固體分散體存在析晶現象，磷脂復合物存在穩定性差等問題，納米結構脂質載體、自微乳制備工藝復雜。

納米混懸劑是在穩定劑作用下通過制劑技術使中藥活性成分形成一種亞微膠體分散體系，無需脂質載體，具有載藥量高、制備工藝簡單等優勢，可有效提高溶解度，促進藥物溶出、體內吸收［12-14］。因此，本實驗制備葫蘆素B 納米混懸劑，并考察其體內藥動學，以期為相關研究提供新思路，也為臨床提供新型相關制劑。

1 材料

SQP 型電子分析天平 ［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］； YC-1800 型實驗室低溫噴霧干燥機（上海雅程儀器設備有限公司）； 安捷倫1200 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）； Axia ChemiSEM 型掃描電鏡（北京歐波同光學技術有限公司）； LC-DMS-S 型加熱磁力攪拌器（力辰科技儀器有限公司）； G2 Autoplus／Autofill 型溶出儀（美國Hanson 公司）； TP-300 型均質機（無錫邁拓環保科技有限公司）； HPT-16 型氮吹儀（上海滬析實業有限公司）； NKT-N9H 型粒度分析儀（山東耐克特分析儀器有限公司）。

葫蘆素B 原料藥（批號201025，純度96.0%，湖北實順生物科技有限公司）； 葫蘆素B 對照品（批號20200410，純度98.5%，上海邁瑞爾生化科技有限公司）； 雌酚酮對照品（批號20200915，純度99%，上海邁瑞爾化學技術有限公司）。微粉硅膠（批號20190225，上海邁峰硅膠有限公司）； 羥丙基纖維素（批號191026，山東戈麥斯化工有限公司）； 十二烷基硫酸鈉（批號20181026，蘇州源泰潤化工有限公司）。

SD 大鼠，雌雄兼具，體質量 （220±20）g，購自河南省動物實驗中心，動物生產許可證號SCXK （豫）2020-0001。

2 方法與結果

2.1 納米混懸劑制備 參考文獻［11，13］報道，取50 mg 葫蘆素B 原料藥，溶于10 mL 無水乙醇中，作為有機相； 取穩定劑適量，溶于50 mL 蒸餾水中，作為水相，加熱至45 ℃，將有機相緩慢滴到水相中（攪拌速度800 r／min），攪拌20 min 后減壓（45 ℃）旋轉蒸發20 min，得混懸液，在80 MPa下循環均質數次，置于-20 ℃冰箱中使體系快速降溫［15］，補加蒸餾水至50 mL，取出，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2 葫蘆素B 含量測定 采用HPLC 法。

2.2.1 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈-水（65 ∶35）； 體積流量1.0 mL／min； 柱溫35 ℃； 檢測波長228 nm； 進樣量10 μL。

2.2.2 線性關系考察 取葫蘆素B 對照品10.40 mg，置于10 mL 量瓶中，乙腈溶解定容至刻度，得1.04 mg／mL 貯備液，流動相依次稀釋至10.4、5.2、2.6、1.04、0.104、0.052 μg／mL，分別取10 μL，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y＝90.66X-10.43 （r＝0.999 9），在0.052～10.4 μg／mL 范圍內線性關系良好。

2.2.3 供試品溶液制備 取納米混懸劑1 mL，置于50 mL 量瓶中，甲醇超聲溶解后流動相定容，取2 mL 至10 mL 量瓶中，流動相定容至刻度，即得。

2.2.4 方法學考察 取納米混懸劑1 份，按“2.2.3” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得葫蘆素B峰面積RSD 為1.54%，表明該方法重復性良好。取供試品溶液1 份，于0、6、12、18、24、48 h在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得葫蘆素B 峰面積RSD 為0.77%，表明溶液在48 h 內穩定性良好。取供試品溶液適量，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得葫蘆素B 峰面積RSD為0.63%，表明儀器精密度良好。取納米混懸劑0.5 mL，置于50 mL 量瓶中，按“2.2.3” 項下方法平行制備9 份供試品溶液，分為低、中、高3組，每組3 份，分別加入1.04 mg／mL 貯備液0.25、0.5、0.75 mL，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得葫蘆素B 平均加樣回收率分別為98.54%、101.06%、100.89%，RSD 分別為0.36%、0.84%、0.70%。

2.3 粒徑、Zeta 電位測定 取納米混懸劑100 μL，蒸餾水稀釋50 倍，混勻，測定粒徑、Zeta 電位，平行3 次，取平均值。

2.4 處方優化 采用單因素試驗。

2.4.1 穩定劑種類 固定葫蘆素B 投藥量50 mg，穩定劑與藥物比例2.5 ∶1，均質壓力80 MPa，均質次數10 次，考察穩定劑種類對粒徑、PDI 的影響，結果見圖1。由此可知，單用PVP K30、羥丙甲基纖維素、阿拉伯膠、十二烷基硫酸鈉時粒徑、PDI 較大； 當2 種穩定劑聯用，即PVP K30＋十二烷基硫酸鈉（1 ∶1）、羥丙基纖維素＋十二烷基硫酸鈉（1 ∶1）、阿拉伯膠＋十二烷基硫酸鈉（1 ∶1）時粒徑、PDI 較低，以羥丙基纖維素＋十二烷基硫酸鈉（1 ∶1）更明顯，最終選擇其作為穩定劑。

圖1 穩定劑種類對粒徑、PDI 的影響（n＝3）Fig.1 Effects of stabilizer type on particle size and PDI（n＝3）

2.4.2 穩定劑與藥物比例 固定葫蘆素B 投藥量50 mg，穩定劑羥丙基纖維素＋十二烷基硫酸鈉（1 ∶1），均質壓力80 MPa，均質次數10 次，考察穩定劑與藥物比例對粒徑、PDI 的影響，結果見圖2。由此可知，在一定范圍內隨著穩定劑比例增加粒徑、PDI 降低，但穩定劑比例過高時兩者反而升高，可能是由于體系黏度增加所致，也可能與過多穩定劑附著在納米粒表面有關，最終選擇3 ∶1 作為穩定劑與藥物比例。

圖2 穩定劑與藥物比例對粒徑、PDI 的影響（n＝3）Fig.2 Effects of stabilizer-drug ratio on particle size and PDI （n＝3）

2.4.3 均質次數 固定葫蘆素B 投藥量50 mg，穩定劑羥丙基纖維素＋十二烷基硫酸鈉（1 ∶1），穩定劑與藥物比例3 ∶1，均質壓力80 MPa，考察均質次數對粒徑、PDI 的影響，結果見圖3。由此可知，在一定范圍內隨著均質次數增加粒徑、PDI降低，但過多時（14 次）兩者反而升高，可能是由于體系溫度急劇升高所致，根據Ostwald 熟化理論，小粒徑藥物會發生溶解，而大粒徑藥物會進一步長大，導致其平均粒徑增加、分布不均勻，最終選擇12 次作為均質次數。

圖3 均質次數對粒徑、PDI 的影響（n＝3）Fig.3 Effects of homogenization frequency on particle size and PDI （n＝3）

2.5 驗證試驗 根據“2.4” 項下結果，確定最優處方為葫蘆素B 投藥量50 mg，穩定劑羥丙基纖維素＋十二烷基硫酸鈉（1 ∶1），穩定劑與藥物比例3 ∶1，均質壓力80 MPa，均質次數12 次。按上述優化工藝放大20 倍，并平行制備3 批樣品，進行驗證試驗，結果見表1，可知粒徑均在200 nm左右（圖4），PDI 在0.140 左右，Zeta 電位在-32 mV 左右（圖5），表明該工藝重復性良好。

表1 驗證試驗結果（n＝3）Tab.1 Results of verification tests （n＝3）

圖4 葫蘆素B 納米混懸劑粒徑分布Fig.4 Particle size distribution of cucurbitacin B nanosuspensions

圖5 葫蘆素B 納米混懸劑Zeta 電位Fig.5 Zeta potential of cucurbitacin B nanosuspensions

2.6 形態觀察 取納米混懸劑0.1 mL，加入5 mL蒸餾水混勻，取T 型支架，覆以銅膠帶，沖洗3次，滴2 滴稀釋后的納米混懸劑，自然晾干，置于離子濺射儀中噴濺60 s，在掃描電鏡（放大50 000倍）下觀察形態，結果見圖6。由此可知，納米粒呈類球形或橢圓形，無粘連。

圖6 葫蘆素B 納米混懸劑掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron microscopic image of cucurbitacin B nanosuspensions

2.7 納米混懸劑固化 采用噴霧干燥法。

2.7.1 支撐劑選擇 課題組前期考察了乳糖、微粉硅膠、甘露醇，發現乳糖、甘露醇所得噴干產物黏性較大，而微粉硅膠所得噴干產物呈干燥、疏松粉末狀態，最終選擇其作為支撐劑。

2.7.2 制備工藝、處方篩選 取3 份納米混懸劑，每份1 000 mL，分別按葫蘆素B 與微粉硅膠用量比1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4 加入微粉硅膠，充分攪拌后得混懸液，得噴霧干燥參數為泵體積流量4.5 mL／min，進風口溫度120 ℃，噴嘴規格型號0.508 mm，出風口溫度55 ～65 ℃，氮氣體積流量0.5 m3／min，所得噴干產物呈干燥、疏松粉末狀態。

取葫蘆素B、物理混合物（葫蘆素B 與微粉硅膠比例1 ∶3）、葫蘆素B 納米混懸劑噴霧粉適量（葫蘆素B 含量均為10 mg），加入5 mL 介質，置于透析袋中（截留分子量8 000 ～12 000 Da），設定溶出介質為1 000 mL 0.5% SDS 溶液，溫度為37 ℃，轉速為75 r／min，于0.5、1、2、3、4、8、10、12 h 取樣，其間及時補液來維持溶出介質總體積不變，過0.45 μm 微孔濾膜，測定累積溶出度，結果見圖7。由此可知，葫蘆素B、物理混合物12 h 內累積溶出度分別為29.90%、31.21%；葫蘆素B 與微粉硅膠用量比為1 ∶2 時，噴霧粉4 h內累積溶出度接近90%，8 h 內基本溶出完畢，兩者比例增加至1 ∶3 后3 h 內累積溶出度達95.23%，但增加至1 ∶4 時體外溶出行為無明顯變化，最終選擇1 ∶3 作為葫蘆素B 與微粉硅膠用量比。

圖7 葫蘆素B 體外溶出曲線（n＝3）Fig.7 In vitro dissolution curves for cucurbitacin B （n＝3）

2.8 納米混懸劑溶解度、質量分數測定

2.8.1 溶解度 取過量葫蘆素B、物理混合物［葫蘆素B 與輔料（羥丙基纖維素、十二烷基硫酸鈉、微粉硅膠）比例同納米混懸劑噴霧粉］、葫蘆素B 納米混懸劑噴霧粉（葫蘆素B 與微粉硅膠用量比1 ∶3），置于10 mL 蒸餾水中，超聲處理30 min 至飽和，室溫下平衡2 d，取適量混懸液，過0.45 μm 微孔濾膜，測定葫蘆素溶解度。結果，三者溶解度分別為44.68、48.07、1.14 mg／mL，即原料藥在納米混懸劑噴霧粉中的溶解度增加至25.5 倍。

2.8.2 質量分數 取納米混懸劑噴霧粉20 mg，置于100 mL 蒸餾水中，加入50% 乙醇超聲溶解，取適量，過0.45 μm 微孔濾膜，取1 mL 續濾液至10 mL 量瓶中，流動相定容，搖勻后測定葫蘆素B含量，計算其質量分數。結果，葫蘆素B 在納米混懸劑噴霧粉中的平均質量分數為14.03%。

2.9 晶型分析 取葫蘆素B、空白輔料（不加葫蘆素B，輔料比例同納米混懸劑噴霧粉）、物理混合物（葫蘆素B＋空白輔料）、葫蘆素B 納米混懸劑噴霧粉適量，進行X 射線粉末衍射（XRPD）分析，條件為Cu-Ka 靶，范圍（2θ）3°～45°，結果見圖8。由此可知，原料藥圖譜中出現大量晶型峰，表明它是一種晶型物質； 物理混合物圖譜中仍可見原料藥主要晶型峰，但強度較弱者消失，可能是被輔料掩蔽，表明原料藥仍為晶型物質； 納米混懸劑噴霧粉圖譜中僅見輔料晶型峰，而原料藥晶型峰全部消失，表明它轉變為無定形狀態。

圖8 各樣品XRPD 圖Fig.8 XRPD patterns for various samples

2.10 穩定性考察 取葫蘆素B 納米混懸劑噴霧粉（葫蘆素B 與微粉硅膠用量比1 ∶3）適量，密封后置于溫度25 ℃、相對濕度60%的恒溫恒濕箱中，于0、1、3、6 個月取樣，測定累積溶出度，結果見圖9。由此可知，納米混懸劑噴霧粉放置6個月后體外溶出基本無變化，表明其穩定性良好。

圖9 不同時間點葫蘆素B 納米混懸劑累積溶出度（n＝3）Fig.9 Accumulative dissolution rates of cucurbitacin B nanosuspensions at different time points （n＝3）

2.11 體內藥動學研究

2.11.1 UPLC-MS／MS 分析條件 參考文獻［8］報道，ACQUITY BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）； 流動相乙腈-0.1% 甲酸（30 ∶70）； 體積流量0.3 mL／min； 柱溫30 ℃； 進樣量5 μL。電噴霧離子源（ESI）； 噴霧電壓5 000 V； 離子源溫度400 ℃； 氣簾氣30 psi （1 psi ＝6.895 kPa）； 多反應監測模式（MRM）； 檢測離子對葫蘆素Bm／z581.2～521.3，雌酚酮m／z269.3～145.1。

2.11.2 分組、造模與給藥 取葫蘆素B、物理混合物（比例同納米混懸劑噴霧粉）、葫蘆素B 納米混懸劑噴霧粉適量，加入0.5%CMC-Na 溶液制成藥液（葫蘆素B 質量濃度均為1.5 mg／mL）。取空腹大鼠18 只，隨機分為3 組，按10 mg／kg 劑量灌胃給予相應藥物，于0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h 吸入乙醚麻醉，并立即于眼眶后靜脈叢采血各約0.25 mL，置于肝素浸潤離心管中，振蕩混勻后3 000 r／min 離心3 min，取血漿，密封后置于-20 ℃冰箱中。

2.11.3 血漿樣品處理 將血漿樣品在37 ℃水浴中解凍后取50 μL，置于離心管中，加入40 μL 644 ng／mL 雌酚酮溶液、1 mL 乙腈，渦旋2 min，加入0.5 mL 乙酸乙酯，渦旋2 min，8 000 r／min離心15 min，取上清液，35 ℃氮氣吹干，50 μL乙腈復溶，8 000 r／min 離心10 min，取上清液。

2.11.4 線性關系考察 取雌酚酮對照品適量，乙腈制成644 ng／mL 溶液，作為內標溶液。取葫蘆素B 對照品，乙腈依次稀釋至950、475、237.5、47.5、23.75、9.5 ng／mL，分別取50 μL 至離心管中，35 ℃氮氣吹干，50 μL 空白血漿復溶，得質量濃度分別為950、475、237.5、47.5、23.75、9.5 ng／mL 的血漿對照品溶液，按“2.11.3” 項下方法處理，在“2.11.1” 項條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），對照品、內標峰面積比值為縱坐標 （Y）進行回歸，得方程為Y＝0.004 1X-0.413 7 （r ＝0.995 9），在9.5 ～950 ng／mL 范圍內線性關系良好。

2.11.5 專屬性試驗 取空白血漿、血漿對照品溶液（9.5 ng／mL）、給藥12 h 血漿樣品適量，在“2.11.1” 項條件下進樣測定，結果見圖10。由此可知，葫蘆素B、內標保留時間分別為6.18、8.42 min，不受其他雜質干擾，表明該方法專屬性良好。

圖10 葫蘆素B 典型MRM 色譜圖Fig.10 Typical MRM chromatograms of cucurbitacin B

2.11.6 方法學考察 取9.5、237.5、950 ng／mL血漿對照品溶液適量，同一天內在“2.11.1” 項條件下進樣測定6 次，測得葫蘆素B、雌酚酮峰面積比值RSD 分別為2.94%、3.60%、3.97%； 同法測定6 d，每天1 次，測得兩者比值RSD 分別為5.65%、4.07%、4.26%，表明該方法日內、日間精密度良好。取給藥0.5 h 血漿樣品適量，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.11.1” 項條件下進樣測定，測得葫蘆素B、雌酚酮峰面積比值RSD為6.04%，表明血漿樣品在24 h 內穩定性良好。制備9.5、237.5、950 ng／mL 對照品溶液，在“2.11.1” 項條件下進樣測定，計算峰面積A； 取空白血漿50 μL，按“2.11.3” 項下方法處理，平行9 份，得空白基質，分別加入9.5、237.5、950 ng／mL 對照品溶液 （含內標）各50 μL，在“2.11.1” 項條件下進樣測定，計算峰面積B，計算提取回收率，公式為提取回收率＝ （A／B）×100%，另取9.5、237.5、950 ng／mL 對照品溶液（含內標）適量，按“2.11.3” 項下方法處理，在“2.11.1” 項條件下進樣測定，計算峰面積C，計算基質效應，公式為基質效應＝ （B／C）×100%，結果葫蘆素B 提取回收率分別為93.69%、96.03%、95.84%，基質效應分別為 96.16%、95.73%、95.91%； 雌酚酮提取回收率為96.96%，基質效應為98.44%，表明基質未對成分測定產生干擾。

2.11.7 結果分析 血藥濃度-時間曲線見圖11，采用DAS 3.2 軟件中的非房室模型計算藥動學參數，結果見表2。由此可知，與原料藥比較，物理混合物tmax、t1／2、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞無明顯變化（P＞0.05），表明輔料不會顯著影響藥物吸收；與原料藥、物理混合物比較，納米混懸劑tmax縮短（P＜0.01），t1／2延長（P＜0.05，P＜0.01），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），相對生物利用度與原料藥相比增加至4.32 倍。

表2 葫蘆素B 主要藥動學參數（x±s，n＝6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for cucurbitacin B （±s，n＝6）

表2 葫蘆素B 主要藥動學參數（x±s，n＝6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for cucurbitacin B （±s，n＝6）

注：與葫蘆素B 比較，△P＜0.05，△△P＜0.01； 與物理混合物比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

參數單位葫蘆素B物理混合物葫蘆素B 納米混懸劑tmaxh3.06±0.513.12±0.631.47±0.36△△＃＃t1／2h4.74±0.664.85±0.715.56±0.97△＃Cmaxng·mL-1236.08±74.72270.76±83.21787.69±216.08△△＃＃AUC0～tng·mL-1·h-11 026.34±176.421 092.34±194.354 438.91±726.44△△＃＃AUC0～∞ng·mL-1·h-11 085.61±185.901 128.67±204.584 586.55±777.61△△＃＃

圖11 葫蘆素B 血藥濃度-時間曲線（n＝6）Fig.11 Plasma concentration-time curves for cucurbitacin B （n＝6）

3 討論

本實驗發現，高壓均質后混懸液體系溫度較高，故通過快速降溫（置于-20 ℃冰箱中）可使納米粒形態、粒徑瞬間變化程度較小，有利于形成粒徑均一的葫蘆素B 納米混懸劑［15］。納米混懸劑固化方法一般是加入凍干保護劑［13-14］，但輔料用量較大，成本較高。另外，乳糖、甘露醇容易吸潮，玻璃化溫度較低［16］，導致噴霧粉黏度較大，而微粉硅膠抗黏性強，支撐效果優異，故本實驗以其為支撐劑，大大減少了輔料用量，也便于工業化生產，并且放置6 個月其穩定性仍良好。

溶解度測定結果顯示，納米混懸劑將葫蘆素B溶解度增加至25.5 倍，3 h 內后者基本全部溶出，可能與其粒徑減小、無定形狀態有關［17-18］。體內藥動學研究結果顯示，葫蘆素B 納米混懸劑t1／2延長，可能是由于納米藥物胃腸道粘附性較強，會對t1／2產生影響［19］；tmax提前，可能與原料藥在前3 h內溶出速率較快有關，同時其溶解度、累積溶出度大大提高，并轉變為無定形狀態，使得Cmax、生物利用度提高［20］。

目前，葫蘆素B 上市片含量不足0.1 mg／片［21］，而按本實驗所得最優處方制成相同規格片劑后，微粉硅膠含量不足0.3 mg／片，遠低于小于2%的要求［22］。另外，十二烷基硫酸鈉口服致死劑量為0.5～5.0 g／kg［21］，而制成上述片劑后其含量約為0.15 mg／片，安全邊際較高。今后，將對葫蘆素B納米混懸劑噴霧粉片劑制備工藝、質量標準、抗婦科腫瘤藥效學等方面展開研究，以期為臨床提供新型相關口服制劑。