2015年5月—2021年12月于菏澤市出生的296 106例新生兒希特林蛋白缺乏致肝內膽汁淤積癥的篩查

劉暢，房振楠，趙芬，汪玉鋒，徐龍芳，王廣榮，王慶華

1 青島大學附屬青島婦女兒童醫(yī)院兒保科，山東青島 266000；2 菏澤市婦幼保健院兒?？?；3 菏澤市婦幼保健院產科；4 菏澤市婦幼保健院新生兒疾病篩查診治中心；5 菏澤市婦幼保健院檢驗科

希特林蛋白缺乏導致肝內膽汁淤積癥屬于希特林蛋白缺乏癥的一種類型，該類型多于新生兒晚期起病［1］，有部分患兒可因嚴重肝硬化或嚴重感染等并發(fā)癥死亡，若早期診斷并干預治療，多數(shù)患兒在1歲左右臨床癥狀及體征將會消失。文獻［2］報道，早期診斷和飲食干預是改善希特林蛋白缺乏導致肝內膽汁淤積癥患兒預后的關鍵。研究［3-6］顯示，亞洲地區(qū)根據(jù)SLC25A13 基因變異率預測希特林蛋白缺乏癥的患病率為1/38 000～1/7 100，而通過新生兒篩查發(fā)現(xiàn)確診的僅有1/82 352［7］，說明肝內膽汁淤積癥患兒在新生兒期存在漏診。隨著應用串聯(lián)質譜法篩查遺傳代謝病的普及，肝內膽汁淤積癥也被作為新生兒篩查疾病的病種之一，但篩查敏感性問題一直在探討中。肝內膽汁淤積癥早期可出現(xiàn)串聯(lián)質譜檢測結果中瓜氨酸顯著升高，但若僅根據(jù)瓜氨酸是否顯著升高來排除診斷存在假陰性患兒。本研究采集2015 年5 月—2021 年12 月菏澤市出生的296 106 例新生兒足跟血，分別采用初篩手段（液相色譜串聯(lián)質譜檢測）和復篩手段［液相色譜串聯(lián)質譜、氣相色譜質譜、血甲胎蛋白（AFP）、SLC25A13 基因檢測］篩查新生中希特林蛋白缺乏導致肝內膽汁淤積癥，并分析比較篩查結果及篩查手段，旨在為提高此病的篩查提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015 年5 月1 日—2021 年12月31 日菏澤地區(qū)出生的新生兒296 106 例。篩查時間：所有新生兒均為產后72 h 或至少充分哺乳6 次后篩查。所有患兒監(jiān)護人均在知情同意下自愿進行檢測，本研究經(jīng)菏澤市婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批，批準號為2017051603。

1.2 初篩手段 初篩手段為液相色譜串聯(lián)質譜檢測。采集新生兒足底血，制成干血濾紙片，2～8 ℃冷藏保存，通過專用冷鏈遞送渠道，5 個工作日內送至篩查中心實驗室。應用API3200MD 三重四極桿質譜儀（美國AB SCIEX 公司）進行液相色譜串聯(lián)質譜分析。共定量分析11種氨基酸和31種?；鈮A，氨基酸包括丙氨酸（ALA）、精氨酸（ARG）、瓜氨酸（CIT）、甘氨酸（GLY）、亮/異亮氨酸（LEU + ILE）、蛋氨酸（MET）、鳥氨酸（ORN）、苯丙氨酸（PHE）、脯氨酸（PRO）、酪氨酸（TYR）、纈氨酸（VAL），?；鈮A包括游離肉堿（CO）、乙酰基肉堿（C2）、丙?；鈮A（C3）、丙二酸?；鈮A（C3DC + C4OH）、丁酰基肉堿（C4）、甲基丙二?；鈮A（C4DC + C5OH）、異戊?；鈮A（C5）、甲基巴豆酰基肉堿（C5︰1）、戊二?；鈮A（C5DC + C6OH）、己?；鈮A（C6）、己二?；鈮A（C6DC）、辛酰基肉堿（C8）、辛烯?；鈮A（C8︰1）、癸?；鈮A（C10）、癸烯酰基肉堿（C10︰1）、癸二烯酰基肉堿（C10︰2）、十二烷?；鈮A（C12）、十二烯酰基肉堿（C12︰1）、十四烷?；鈮A（C14）、十四烯?；鈮A（C14︰1）、十四二烯?；鈮A（C14︰2）、3-羥基十四烷酰基肉堿（C14OH）、十六烷?；鈮A（C16）、十六烯?；鈮A（C16︰1）、3-羥基十六烷?；鈮A（C16OH）、3-羥基十六烯?；鈮A（C16︰10H）、十八烷?；鈮A（C18）、十八烯?；鈮A（C18︰1）、十八二烯?；鈮A（C18︰2）、3-羥基十八烷?；鈮A（C18OH）、3-羥基十八烯酰基肉堿（C18︰10OH）。參考范圍：CIT 5.5～33 μmol/L，MET 11～55 μmol/L、PHE 24～105 μmol/L、TYR 40～330 μmol/L、ARG 1～70 μmol/L。

1.3 復篩手段 復篩手段為液相色譜串聯(lián)質譜、氣相色譜質譜、血甲胎蛋白（AFP）、SLC25A13 基因檢測及治療評估。8 例初篩高度懷疑，通過后續(xù)檢查確診；5 例初篩瓜氨酸數(shù)值略升高或正常范圍高限，但伴有其他氨基酸水平異常，再次進行復篩確診；3例篩查為陰性，后因黃疸、肝功能異常等住院治療時再次進行串聯(lián)質譜分析；14例患兒行基因檢測。

1.3.1 液相色譜串聯(lián)質譜檢測 檢測方法同“1.2”。

1.3.2 氣相色譜質譜檢測 采集可疑患兒新鮮尿液制成尿紙片，進行尿氣相色譜質譜檢測，可檢測包括氨基酸、單糖、雙糖、嘧啶、嘌呤、核酸、脂肪酸、脂質等在內的132 種小分子代謝物，該檢測由第三方檢測機構執(zhí)行，其中需要特別注意的為4-羥基苯丙酮酸（參考范圍0～5 μmol/mol）和4-羥基苯乳酸（參考范圍0～20 μmol/mol）。

1.3.3 AFP 檢測 抽取患兒靜脈血2～3 mL，采用邁瑞-2000 化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，以及相應配套的mindray試劑盒檢測血中AFP，操作嚴格按照試劑盒操作說明，正常參考范圍1～7 ng/mL。

1.3.4 SLC25A13基因檢測 應用乙二酸四乙酸鈉（EDTA）抗凝管采集患兒外周靜脈血2～3 mL，對于SLC25A13基因采用第二代測序進行檢測，同時進行Sanger驗證，以及對相關致病基因突變進行分析，對患兒父母基因組DNA相應陽性位點檢測，明確該基因突變位點是否來源于父母，或為新發(fā)基因突變位點。

1.4 治療方法 對于有臨床表現(xiàn)，高度懷疑肝內膽汁淤積癥，常規(guī)治療效果欠佳且易反復的患兒，早期可嘗試性給予無乳糖特殊奶粉（藹兒舒/中鏈脂肪酸/牛百肽），嬰兒期添加輔食時囑少吃碳水化合物，注意補充維生素A、D、K、E等脂溶性維生素，必要時給予精氨酸、苯甲酸鈉等降血氨［1］治療，根據(jù)治療效果來篩選是否為肝內膽汁淤積癥。

2 結果

2.1 初篩結果 初篩出可疑患兒13 例（患兒編號由A～M），蛋氨酸明顯升高患兒共8 例（患兒A～患兒H），由于初篩年齡不同，瓜氨酸數(shù)值也有所差異，中位數(shù)為 263.6 μmol/L，四分位間距為342.39 μmol/L。 患兒A 同時伴有蛋氨酸（99.63 μmol/L）升高，患兒B 與患兒G 的蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸均升高，患兒E 伴有苯丙氨酸（300 μmol/L）、酪氨酸（416 μmol/L）升高，患兒F蛋氨酸（73.97 μmol/L）、苯丙氨酸（133 μmol/L）略升高。其余初篩異常患兒中，患兒I 僅進行四病篩查，表現(xiàn)為苯丙氨酸（354 μmol/L）顯著升高，需召回復診?；純篔～患兒M 中蛋瓜氨酸數(shù)值略升高或位于正常范圍高限，伴或不伴有其他氨基酸水平的異常，其中瓜氨酸數(shù)值依次為34.18 μmol/L（患兒J）、32.82 μmol/L（患兒K）、44.88 μmol/L（患兒L）、41.1 μmol/L（患兒M），而患兒K伴有C14、C16、C16︰1的升高，患兒L 伴有精氨酸（212.7 μmol/L）升高。其他未描述患兒余氨基酸數(shù)值均在正常范圍內。

2.2 復篩結果

2.2.1 液相色譜串聯(lián)質譜結果 患兒A 未及時復診，于28 d 死亡，患兒D 與患兒J 因“黃疸”于外院住院治療，均未檢測?；純築 瓜氨酸（282.5 μmol/L→420 μmol/L）、精氨酸（85.94 μmol/L→254 μmol/L）較前明顯升高，蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸與初篩無明顯差異（仍升高）。而患兒G瓜氨酸較前無明顯變化，除精氨酸（80.78 μmol/L→132 μmol/L）升高外，蛋氨酸、苯丙氨酸恢復至正常?；純篍 瓜氨酸（244.7 μmol/L→477 μmol/L）升高，精氨酸由正常數(shù)值（48.31 μmol/L）升至134.5 μmol/L，苯丙氨酸、酪氨酸與初篩無明顯差異（仍升高）?；純篎的蛋氨酸（55.51 μmol/L）較前無明顯變化，苯丙氨酸（62.87 μmol/L）降至正常，取而代之的是酪氨酸（282 μmol/L→357.1 μmol/L） 、 精 氨 酸（62.59 μmol/L→165 μmol/L）升高。患兒I 復篩時進行串聯(lián)質譜檢測時顯示瓜氨酸（596 μmol/L）、蛋氨酸（121 μmol/L）、苯丙氨酸（155.2 μmol/L）、精氨酸（140 μmol/L）均升高。 患兒C 精氨酸（38.96 μmol/L→139 μmol/L）較初篩值升高。患兒H 復篩除瓜氨酸（99.61 μmol/L→265 μmol/L）較前升高外，余氨基酸水平無明顯改變?；純篕、患兒L、患兒M 的瓜氨酸（依次為333 μmol/L、496 μmol/L、497 μmol/L）均顯著升高，患兒K 復篩時C14、C16、C16︰1 恢復正常，而精氨酸（475 μmol/L）升高。患兒L 精氨酸較前變化不大，患兒M 酪氨酸（123.66 μmol/L→354.1 μmol/L） 、精 氨 酸（20.19 μmol/L→141 μmol/L）升高?；純篘、患兒O、患兒P 串聯(lián)質譜結果各項指標均未見異常（為漏篩病例），未進行復篩，后期因“皮膚黏膜黃染并進行性加重”住院治療時，復篩串聯(lián)質譜等檢查，瓜氨酸均顯著升高，依次為541 μmol/L、267 μmol/L、150 μmol/L，患兒N 伴有蛋氨酸（95.85 μmol/L）升高，患兒O 伴有蛋氨酸（74.79 μmol/L）、精氨酸（71.56 μmol/L）略升高，患兒P余氨基酸水平正常。

2.2.2 氣相色譜質譜結果 除患兒A、患兒D、患兒J 未檢測，余患兒（包括患兒N、患兒O、患兒P）4-羥基苯丙酮酸、4-羥基苯乳酸均顯著升高。4-羥基苯丙酮酸中位數(shù)為82.3 μmol/mol，四分位間距為342.39 μmol/L；4-羥基苯乳酸位數(shù)為645.1 μmol/mol，四分位間距為733.6 μmol/L。

2.2.3 血AFP 結果 除患兒A、患兒D、患兒J 未檢測，其他患兒（包括患兒N、患兒O、患兒P）AFP 數(shù)值均明顯升高，其中患兒B、患兒C、患兒E、患兒H、患兒I、患兒K 數(shù)值均超過測量范圍最高限（>80 000 ng/mL），余患兒中位數(shù)為47 882.5 ng/mL，四分位間距為5 8320 ng/mL。

2.2.4 SLC25A13 基因結果 除患兒A 和患兒B，其他患兒（共14 例）均進行基因檢測，患兒F 為等位基因純和突變（突變位點c.852_855del，父母各攜帶一個），患兒L、患兒M、患兒O 只檢測出一個突變位點（但根據(jù)串聯(lián)質譜、尿有機酸分析、甲胎蛋白、肝腎功能、臨床表現(xiàn)以及治療效果評估均可臨床確診），患兒O 提示突變來源于母親，患兒L 與患兒M 在父母基因中均未檢測到。余患（共10例）為雜合突變，且突變均來自于父母，無新發(fā)突變。共有11 個突變位點，其中錯義突變1 個：c. 1475G>A，移碼突變1個：c.1638_1660dup，插入突變1 個：IVS16ins3kb，整碼突變1 個：c. 852_855del，剪切位點突變3 個：c.615 + 5G>A、c.1177 + 1G>A、c.755-1G>C，無義突變3 個：c.742G>A、C.1078C>T、c.955C>T、c.889G>T。最常見的突變位點為c. 852_855del，占50%，第二常見突變位點為IVS16ins3kb，占33%。

2.3 治療結果評估 患兒治療后除患兒L失訪、患兒A死亡外，余患兒均定期監(jiān)測患兒體格發(fā)育、營養(yǎng)狀況，每1～3月檢測串聯(lián)質譜、尿有機酸分析、甲胎蛋白、肝腎功能、血脂、血糖；每3～6月采用Gessell兒童發(fā)育量表測定發(fā)育商（DQ），各項異常指標均較前明顯下降，并逐漸恢復正常，皮膚黏膜黃染明顯好轉。

3 討論

各地區(qū)新生兒篩查確診肝內膽汁淤積癥有所差異。浙江省186 萬新生兒篩查中，篩查確診29例，檢出率為1/68 935，漏篩2例，患病率為1/64 138［8］。湖南省565 182 例新生兒篩查中，篩查確診6 例，檢出率（即患病率）為1/94 197［9］。廣州市124 250 例新生兒篩查對象中，篩查確診1 例，檢岀率為1/124 250，發(fā)現(xiàn)3 例假陰性，患病率1/31 062［10］。徐州地區(qū)共篩查新生兒461 494 例，最終明確13 例，檢出率（即患病率）1/36 038。LIN 等［6］的研究顯示，人群中肝內膽汁淤積癥的患病率為1/26 403。本研究中，菏澤地區(qū)共篩查296 106 例新生兒，肝內膽汁淤積癥患兒16例，篩查確診13例，檢出率1/22 777，假陰性3 例，患病率1/18 506，明顯高于其他省市發(fā)病率，雖與LIN 等的研究相近，但也存在差異，這是否與樣本量少、統(tǒng)計年限短以及生活條件等因素相關，有待進一步研究論證。

肝內膽汁淤積癥是由SLC25A13 基因的雙等位基因突變引起的一種疾病，在東亞人群中相對常見。SLC25A13 基因位于染色體7q21.3，由18 個外顯子組成，轉錄翻譯成一種具有二聚體結構位于線粒體內膜的鈣結合性跨膜天冬氨酸/谷氨酸載體蛋白（希特林蛋白），共有675個氨基酸［11］，主要參與蘋果酸—天冬氨酸的穿梭過程中谷氨酸—天冬氨酸轉運，同時向線粒體內提供一個質子H +［12］。當基因突變導致希特林蛋白功能障礙時，天冬氨酸無法從線粒體轉運至胞質，胞質中天冬氨酸不足，抑制精氨酸代琥珀酸合成酶，從而引起尿素循環(huán)障礙、蛋白質合成受阻、肝細胞脂肪變性，導致血中瓜氨酸升高。同時機體可能通過其他氨基酸代償進一步彌補尿素循環(huán)功能及能量代謝障礙，使其他氨基酸出現(xiàn)相應的改變［13］，如蛋氨酸、苯丙氨酸等。本研究中患兒的串聯(lián)質譜分析結果與之相對應。本研究中SLC25A13 基因最常見的突變位點為c.852_855del，與陜西地區(qū)研究顯示最常見位點［14］相似。而另有研究［15］顯示，此突變位點在南方地區(qū)更常見且明顯多于北方地區(qū)。這種差異可能與數(shù)據(jù)偏倚以及樣本量較少有關。第二常見突變位點為IVS16ins3kb，這與CHEN 等的研究相呼應［16］。 但少數(shù)患兒的SLC25A13 基因僅發(fā)現(xiàn)1 個突變位點，這可能與該地區(qū)經(jīng)濟條件所限，大部分患兒僅進行SLC25A13 基因靶向測序，使位于內含子、調控區(qū)的基因突變不易檢出有關。而少數(shù)進行全基因組外顯子檢測的患兒，當基因存在大片堿基插入或堿基缺失突變時，傳統(tǒng)的基因檢測手段無法檢測，需結合cDNA 克隆或進行功能分析［17］，這使檢測難度進一步增加。雖然基因檢測未能明確診斷，但是根據(jù)臨床表現(xiàn)、生化結果以及給予無乳糖奶粉治療后效果顯著均提示為肝內膽汁淤積癥。

值得注意的是，本文報道的患兒K 及患兒I，患兒K（3日齡時）初篩結果示瓜氨酸在正常范圍高值，但C14、C16以及C16︰1明顯升高，遂召回復篩，患兒復篩時為31日齡，查體示精神差，刺激反應欠佳，皮膚黃染至腹部，肝臟未觸及明顯腫大，復篩結果示瓜氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸均顯著升高，同時查肝功未見明顯異常，腹部超聲僅表現(xiàn)為膽囊內略強回聲。部分研究顯示隨著時間的推移，肝內膽汁淤積癥患兒的長鏈酰基肉堿（包括C14、C16）可成逐步上升趨勢［18］，這可能與線粒體中脂肪酸的β-氧化（FAO）受到抑制相關［19］，肉堿作為長鏈脂肪酸的唯一載體，當長鏈?；鈮A水平升高時，長鏈脂肪酸也相應增多，長鏈脂肪酸以甘油三酯的形式儲存在脂肪組織中。該患兒SLC25A13 基因為復合雜合突變（c.615 + 5G>A/c.742G>A），王彩虹等曾報道1例攜帶有c.615 + 5G>A 的復雜雜合突變的患兒，也伴有甘油三酯的升高，但同一報道中攜帶相同突變的另一患兒并未升高［20］，另一突變位點c. 742G>A 使位于第248 位的酸性氨基酸谷氨酸突變?yōu)閴A性氨基酸賴氨酸，其臨床意義未明確，有待進一步的研究分析基因型與表型是否相關。而患兒I 僅進行四病篩查，篩查時提示苯丙氨酸升高，遂召回復篩串聯(lián)并完善相關檢查后確診，再次提醒臨床兒科醫(yī)師，單純苯丙氨酸升高時，除排除常見的高苯丙氨酸血癥以外，也要注意與肝內膽汁淤積癥鑒別以防漏診。

因肝內膽汁淤積癥患兒早期（3～7 日齡時）不伴有臨床癥狀時，瓜氨酸升高可不顯著，這導致僅基于串聯(lián)質譜的新生兒篩查技術準確診斷肝內膽汁淤積癥具有挑戰(zhàn)性，當肝內膽汁淤積癥患兒表現(xiàn)出典型的膽汁淤積時，血氨基酸譜也發(fā)生改變，以瓜氨酸升高為主要特點，可伴有蛋氨酸、鳥氨酸、酪氨酸等明顯升高［6，11］。但延期進行足底血篩查的風險更大，是否具有可行性有待于更進一步。雖有研究顯示，iPLEX 檢測可顯著提高新生兒肝內膽汁淤積癥的篩查陽性率，但基于經(jīng)濟等問題未應用于臨床。研究發(fā)現(xiàn)，與新生兒篩查確診及時治療的患兒相比，在新生兒篩查中被漏診，后期發(fā)病確診的患兒，臨床癥狀更重、更急。這對于兒科醫(yī)師而言，早期確診顯得尤為重要，即使患兒初次串聯(lián)質譜結果正常，當出現(xiàn)臨床癥狀（如常規(guī)治療后皮膚黏膜黃染進行性加重、肝脾腫大、肝功能異常等），應再次復篩串聯(lián)質譜檢測，必要時結合氣相色譜質譜、血AFP 以及基因檢測，以盡早確診，提高診出率，降低假陰性的發(fā)生率。

總之，串聯(lián)質譜技術是篩查肝內膽汁淤積癥最常用檢測手段之一，部分早期瓜氨酸值改變不明顯患兒，伴或不伴有其他氨基酸（如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸）異常，復篩時聯(lián)合尿氣相色譜、血AFP、SLC25A13 基因檢測等可提高檢出率，基因檢測作為診斷肝內膽汁淤積癥的金標準仍有局限性，即使未檢測出突變位點，根據(jù)化驗檢測、臨床表現(xiàn)以及治療有效可臨床確診。需要特別注意的是，少部分患兒即使初次串聯(lián)質譜結果正常，當出現(xiàn)臨床癥狀（如常規(guī)治療后皮膚黏膜黃染進行性加重、肝脾腫大、肝功能異常等）時，應即使給予復篩串聯(lián)質譜檢測，以早期提高診出率。