牛樟芝種質資源分析及其Antcin 類化合物對乳腺癌細胞的影響

溫葉艷，張引蓮，張煜隆，林紫璇，林冬梅，林興生，李 晶*

（1.福建農林大學菌草科學與技術研究院/國家菌草工程技術研究中心，福建 福州 350002；2.福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002）

牛樟芝（Taiwanofungus camphoratus M.Zang & C.H.Su）是中國臺灣特有的珍稀藥用菌，又名牛樟菇、樟芝，是多年生蕈菌類，具有圓柱形擔孢子，菌絲呈黃色、棕紅色或紅色，子實體生長在中國臺灣特有的牛樟樹中空內壁上，呈暗棕紅色，形狀呈不規則狀。牛樟芝Antcin 類化合物是其主要活性物質，常被用于解毒、止痛，具有抗氧化和抗腫瘤作用[1]。據國際抗癌協會資料統計，乳腺癌是女性發病率最高的惡性腫瘤，全世界每年約120 萬婦女發病，其中約50 萬人死于乳腺癌，且發病率在中國逐年上升，對社會家庭產生巨大的影響[2]。牛樟芝中Antcin A、Antcin K、Antcin H等化合物具有不同的抗腫瘤活性作用[3]。Hsieh 等[4]認為Antcin A、Antcin C 和Methyl anticiante A 可選擇性抑制人類癌細胞而非正常細胞的增殖；Methylantcinate B 和Antcin B 被認為是對各種類型癌細胞的強細胞毒性藥物[5]；Antcin A 能抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲，可作為開發乳腺癌治療抗轉移藥物的先導制劑[6]。分子生物學技術已成為21 世紀科技革命的主要技術之一，DNA 分子標記技術是分子生物學技術的重要組成部分，成為作物遺傳育種、品種鑒定、遺傳多樣性分析、基因定位和克隆等研究的重要手段。在食用菌研究中，DNA 分子標記技術和基因轉化技術等已廣泛應用于生物遺傳多樣性、種群結構、種質鑒定和物種鑒別中[7]。其中簡單重復序列區間長度多態性（Inter Simple Sequence Repeat，ISSR）和基于ITS 限制性內切酶片段長度多態性分析（Internal Transcribed Spacer-Restriction Fragment Length Polymorphism，ITS-RFLP）技術成為研究真菌遺傳多樣性較為常見的分子技術之一[8]，該方法具有簡便、快速、低成本和重復性好等特點[9]。BOX-PCR 指紋圖譜分析技術與重復片段PCR基因指紋分析（Repetitive DNA PCR-based Genomic Fingerprinting，REP-PCR）和分型法基于腸桿菌基因間重復共有序列（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR，ERIC-PCR）技術相似，但其操作更為簡單快捷，容易獲得較為豐富的擴增條帶，不需要菌株的特異性DNA 探針，僅需要一條單引物就能夠完成大量菌株的DNA 多態性分析，已被廣泛應用于品種鑒定[10]。文章通過收集牛樟芝菌株并使用DNA 分子標記技術對其進行種質資源分析，并對從牛樟芝中提取到的Antcin 類化合物開展其對乳腺癌細胞的增殖、轉移等研究，探討Antcin 類化合物的協同作用，為開發乳腺癌治療藥物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗菌株和細胞

本研究所使用供試菌株均由筆者收集并保存于福建農林大學國家菌草工程技術研究中心，乳腺癌細胞由中國臺灣中興大學樹木代謝組學和天然藥物開發實驗室王升陽教授提供（表1）。

表1 供試菌株及細胞來源

1.1.2 主要工具酶及試劑

牛樟芝固體培養基主要配方為2.5%葡萄糖、0.5% 蛋白胨、0.3% 麥芽糖、0.3% 酵母提取物、0.1% KH2PO4、0.1% MgSO4·7H2O、0.1%維生素B1、0.25%檸檬草水提取物[10]、2%瓊脂粉，培養基于121 ℃滅菌20 min 后倒平板冷卻備用。Antcin B（ATB）和Antcin H（ATH）化合物從牛樟芝AC001 子實體中分離得到，純度均＞99%[11]。2 × Taq Master Mix、D2000（plus）Marker、真菌DNA 提取試劑盒、限制性內切酶EcoR I，Dra I，BspD I，Apal I，MspA1 I 等購于NEW ENGLAND BIOLABS 公司，二甲基亞砜（DMSO），Roswell Park Memorial Institute-1640 培養基（RPMI），胎牛血清（FBS），丙酮酸鈉，三苯氧胺（Tamoxifen，TAM），青霉素（Penicillin，AMP）、吉姆薩染色液（Giemsa） 等由Invitrogen（Carlsbad，CA） 提供，Matrigel 基質基底膜由Discovery Labware（Bedford，USA）提供，其他試劑均為國產分析純。本文主要引物均由福州尚亞生物技術有限公司合成（表2）。

表2 本研究所用引物

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA 提取

將供試菌株采用牛樟芝固體培養基平板進行活化，分別取新鮮菌絲體按真菌DNA 提取試劑盒說明書要求操作，經Nanodrop 2000 檢測濃度和純度合格后-20 ℃保存備用。

1.2.2 ITS-RFLP 序列擴增供試菌株

ITS 序列擴增反應體系為25 μL，其中2 × Taq Master Mix1 2.5 μL、DNA 模板1 μL、ITS1 與ITS4 引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 擴增程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環，最后72 ℃延伸7 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后進行產物回收、純化和測序。

通過限制性內切酶EcoR I，Dra I，BspD I，Apal I，MspA1 I 對ITS PCR 產物進行酶切。反應體系（總體積30 μL）：10 × FastDigest Green Buffer 2 μL、FastDigest enzyme 1 μL、PCR 產物10 μL、ddH2O 17 μL。酶切程序：37 ℃反應5 min 后65 ℃加熱10 min 使酶失活。以1%瓊脂糖凝膠，100 V 電壓電泳30 min，經切膠回收測序后，所得到的序列與NCBI 中GenBank 數據庫做比對分析。序列采用軟件MEGA7.0 以鄰接（Neighbor-joining，簡稱NJ）法構建進化樹，以外源菌株金福菇TO03 作為外源對照。

1.2.3 BOX-PCR 序列擴增

BOX-PCR 序列擴增反應體系為25 μL，其中包括2 × Taq Master Mix 3.3 μL，DNA 模板1 μL，引物1 μL，ddH2O 19.7 μL。PCR 擴增程序：95 ℃預變性7 min，94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸8 min，30 個循環，最后72 ℃延伸15 min。PCR 產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳后拍照記錄。

1.2.4 ISSR 序列擴增

ISSR 序列擴增反應體系為25 μL，包括2 × Taq Master Mix 12.5 μL，DNA 模板1 μL，引物1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR 擴增程序：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，以50～60 ℃復性45 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環，最后72 ℃延伸7 min。PCR 產物經1 % 瓊脂糖凝膠電泳后拍照。采用軟件Ntsyspc 2.10e 以非加權組平均法（UPGMA）聚類分析和Tree Plot 法對凝膠電泳圖進行分析并建立進化樹。

1.2.5 乳腺癌細胞培養及MTT 試驗

將乳腺癌細胞MDA-MB-231 接種在含有10%胎牛血清、1.5 g·L-1NaHCO3和100 U·L-1AMP 的RPMI 培養基中，在5% CO2培養箱中37 ℃繼代培養至第6 代，以第7 代MDA-MB-231 細胞為實驗對象。

MTT 試驗是將MDA-MB-231 細胞分別以104個·孔-1（200 μL） 的密度接種在含有10% FBS、1.5 g·L-1NaHCO3和1%青霉素的RPMI 培養基的96 孔細胞培養板中，分別以0、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1的ATB、ATH 和ATB+ATH 組合分別處理MDA-MB-231 細胞24 h 和72 h，以490 nm 處的吸光度值設置細胞增殖率為100%，計算Antcin 類化合物對乳腺癌細胞致死率。

1.2.6 劃痕試驗

將2 × 104個·孔-1（70 μL）MDA-MB-231 細胞接種到具有無硅細胞培養插入物的6 孔培養板中，培養24 h 后取出插入物，用PBS 洗滌孔中細胞，加入2 mL無FBS 的RPMI 培養基和一定濃度的ATB、ATH 分別繼續培養12 h、24 h 和48 h，以5 μmol·L-1TAM 處理組為陽性對照（下同），并在0 h、12 h、24 h 和48 h 用倒置顯微鏡對細胞生長情況進行記錄，以監測細胞在培養皿中的遷移情況，并通過軟件ImageJ 分析處理組與對照組相比的細胞遷移百分比。

1.2.7 Transwell 侵襲試驗

10 μL Matrigel 基質放于聚碳酸酯膜濾膜上，37℃保溫2 h 使其凝固；收集培養好的MDA-MB-231 細胞經無FBS 的RPMI 培養基洗3 次并調整細胞濃度為104個·mL-1（200 μL），加入一定濃度ATB、ATH。底部腔室中加入700 μL 含FBS 的RPMI 培養基作為趨化因子。細胞在培養箱中培養24 h 后，用4 ℃甲醇固定濾膜上的細胞15 min，采用Giemsa 染色溶液染色30 min 后用PBS 洗滌若干次。最后，通過顯微鏡（200×）拍攝照片，并用軟件ImageJ 分析細胞數量。

1.2.8 成球試驗

將200 μL Matrigel 作為粘性層滴注在6 孔細胞培養板上，并在37 ℃下保溫2 h 使其凝固。制備以104個·孔-1（2 mL）MDA-MB-231 細胞接種到RPMI 培養基中，待細胞完全沉降后，用含5%基質凝膠的完全培養基代替RPMI 培養基，培養時間共15 d，每3 d 更換1 次培養基，結束后用PBS 洗滌表面細胞后采用Giemsa 染色溶液染色30 min，最后用PBS 洗滌若干次，自然晾干后在顯微鏡下記錄結果。

1.2.9 數據處理

每項試驗均設置3 個重復，使用軟件Graphpad prism 5.01 對數據進行統計分析，結果以平均值± 標準差表示，使用ANOVA 方差分析與t 檢驗對數據進行統計評估，所有統計分析結果中* 表示在P<0.05具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 ITS-RFLP 序列擴增

ITS-PCR 擴增序列經瓊脂糖凝膠電泳得到的片段大小約750 bp （圖2），對供試菌株的ITS 序列和NCBI 中比對的近20 條序列的遺傳距離進行分析（圖3）。結果發現，AC001 與AC005 親緣關系較近，而AC002、AC003、AC004 和AC006 親緣關系較近。

圖1 供試菌株

圖2 供試菌株ITS 擴增的PCR 譜帶

圖3 Neighbor-joining 法構建的ITS 序列系統發育樹

酶切結果如圖4 所示，不同牛樟芝菌株的條帶間并未有明顯區別，無法顯著區分菌株間差異。

圖4 不同限制性內切酶對ITS 序列進行酶切后產物

2.2 BOX-PCR 序列擴增

如圖5 所示，采用BOXAIR 引物擴增的條帶均在250～2000 bp，不同牛樟芝菌株條帶在1500 bp 左右，且與金福菇TO03（CK）菌株條帶區別顯著。

圖5 BOX-PCR 擴增條帶凝膠電泳

2.3 ISSR 序列擴增

由圖6 可見，從28 條ISSR 常用引物中篩選出擴增條帶清晰、重復性好、多態性高的引物，主要包括P1、P4、P5、P13、P14、P23、P24、P25，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果發現，不同引物可以通過條帶顯著區分不同菌株間差異性，ISSR 擴增多態性譜帶采用UPGMA 法進行聚類分析，結果共獲得812 條多態性條帶，多態性條帶比例達41%。表明其遺傳多樣性較為豐富，牛樟芝菌株與金福菇菌株之間的遺傳相似系數為0.34，說明二者親緣關系較遠；6 株牛樟芝菌株之間也存在不同程度的相對親緣關系，在遺傳相似系數0.48 處可聚為3 類，其中AC002、AC003、AC004和AC005 可以聚為一類（圖7）。

圖6 部分ISSR 引物擴增凝膠電泳譜帶

圖7 UPGMA 聚類圖譜

2.4 Antcin 類化合物對細胞毒性的作用

通過MTT 法分別測定牛樟芝ATB 和ATH 對MDA-MB-231 細胞毒性結果表明，與0.05% DMSO（CK）相比，10 μmol·L-1ATB 處理、40 μmol·L-1ATH處理對細胞毒性的作用無顯著性差異（P＞0.05），且5 μmol·L-1ATB 處理和20 μmol·L-1ATH 處理菌株在24 h 和72 h 條件下對細胞毒性的作用無顯著性差異（P＞0.05）；當ATB 濃度高于10 μmol·L-1和ATH 高于5 μmol·L-1時，細胞活力在72 h 內以劑量依賴性方式逐漸降低（P＞0.05）。因此，本研究采用5 μmol·L-1ATB和20 μmol·L-1ATH 組合，10 μmol·L-1ATB、40 μmol·L-1ATH 的非細胞毒性濃度進行后續研究（圖8）。

圖8 ATB 和ATH 組合模式對MDA-MB-231 細胞毒性的影響

2.5 Antcin 類化合物對細胞遷移的影響

如圖9 所示，ATB+ATH 組在48 h 時的閉合面積與0 h 時的相比僅減小13.30%，而與陰性對照組（Neg）相比減小了48.2%（P＜0.05），表明2 種化合物共同作用可對MDA-MB-231 細胞遷移起到協同作用。

圖9 Antcin 類化合物對MDA-MB-231 細胞遷移作用的影響

2.6 Antcin 類化合物對細胞侵襲的影響

與陰性對照組（Neg） 相比，ATB、ATH 和ATB+ATH 均能顯著抑制MDA-MB-231 細胞的侵襲能力（圖10-a），且ATB+ATH 組與陽性對照組（TAM）無顯著性差異（P＞0.05）（圖10-b）。

圖10 ATB 和ATH 化合物對MDA-MB-231 侵襲的抑制作用（24 h）

2.7 Antcin 類化合物對細胞成球作用的影響

如圖11 所示，乳腺癌細胞在無任何干預的情況下經培養15 d 后具有顯著的成球現象，而通過添加ATB、ATH 和ATB+ATH 均能顯著抑制MDA-MB-231細胞的成球，從而抑制癌細胞在體內成瘤。

圖11 ATB 和ATH 化合物對乳腺癌細胞成球的抑制作用

3 討論

采用ITS-RFLP、ISSR 和BOX-PCR 技術對收集到的牛樟芝菌株進行分類，其中BOX-PCR 和ISSR 技術能通過特定的引物區分不同菌株間的差異，且研究結果不受生長階段和形態限制，大大增加了鑒定的準確性和科學性，從分子水平為牛樟芝的準確分類、鑒定提供了科學依據。ITS-RFLP 分子標記技術一般用于鑒定真菌物種及屬內物種間系統發育關系，ITS 序列上的5.8 S、18 S 和28 S rRNA 基因具有極大保守性，且絕大多數真核生物在此區域都表現出極為廣泛的序列多態性[12]，然而限制性內切酶的篩選是該技術的重點，筆者篩選EcoR I、Dra I、BspD I、Apal I、MspA1 I 等常見限制性內切酶對ITS 片段進行處理，由于供試牛樟芝菌株之間相似度較高，所選限制性內切酶難以分辨出明顯差異，因此進一步篩選更高效的內切酶用于區分該菌株片段是今后研究重點。Antcin類化合物是牛樟芝中的主要活性物質，對癌細胞增殖、侵襲和轉移等均有顯著作用[13]。目前，已有研究表明，單一Antcin 類化合物（Antcin A，Antcin C，Antcin K 和Antcin H）對治療小鼠風濕關節炎、肥胖、腦出血、抗炎癥等病癥具有顯著療效[14]。然而對于ATB 和ATH 疊加后的協同作用卻少有研究，文章對MDAMB-231 中細胞活力、細胞遷移以及細胞侵襲的影響研究表明，ATB+ATH 組在48 h 時的閉合面積與0 h時相比僅減小13.30%，而與陰性處理組相比減小了48.2%（P＜0.05）；且ATB+ATH、ATB 和ATH 均能顯著抑制MDA-MB-231 細胞的侵襲（P＜0.05），ATB+ATH與陽性對照組（TAM）無顯著性差異（P＞0.05），能顯著抑制MDA-MB-231 細胞的成球，從而抑制癌細胞在體內成瘤，因此，ATB+ATH 協同作用能有效抑制乳腺癌細胞的增殖。生物活性化合物通過對免疫系統的有益作用以及對癌細胞的直接細胞毒性作用，對癌癥治療產生間接影響，從而有效抑制癌細胞的黏附、遷移和侵襲[15]。

4 結論

通過多種DNA 分子標記技術開展牛樟芝種質資源研究，規范菌種市場顯得尤其重要。本研究收集了6株牛樟芝菌株并對其進行親緣分析；從中分離出的牛樟芝Antcin 類化合物ATB 和ATH 對乳腺癌細胞的轉移、侵襲等具有顯著抑制作用，能為其在動物試驗和臨床應用提供理論依據。

致謝：感謝中國臺灣中興大學樹木代謝組學和天然藥物開發實驗室王升陽教授、Kumar 博士和王雅昀博士對本研究細胞實驗進行指導。