短短芽孢桿菌X23中基因的克隆、原核表達及轉錄時相分析

杜杰 蔡海林 黃彬彬 黃軍 張翠央 龍青山 張亮 陳海榮 唐冰璇 陳武 劉清術

摘 要：短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）X23可產生非核糖體肽類抗生素伊短菌素，已被廣泛用于植物病害的生物防治。伊短菌素合成基因簇中，edeB基因參與調控伊短菌素的合成積累。本研究利用基因同源重組技術，以edeB基因作為外源基因的重組片段，構建了原核表達載體pET28a-edeB，轉化至大腸桿菌BL21（DE）中進行誘導表達；通過轉錄組測序檢測edeB基因在短短芽孢桿菌不同培養時間（12、18、24、30和36 h）的轉錄時相。結果表明：edeB基因全長為771 bp，編碼256個氨基酸。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）顯示，在分子質量為30 kD處有一條特異條帶，與生物信息學預測的EdeB蛋白的大小一致，且EdeB蛋白主要以包涵體的形式存在。轉錄時相分析結果表明，edeB基因在各個培養時間點均有表達，表達模式為先升高后降低，且在30 h時表達水平最高。這些結果為進一步研究edeB基因調控伊短菌素合成積累的分子機制奠定了基礎，為短短芽孢桿菌高產伊短菌素菌株的構建提供了理論依據。

關鍵詞：短短芽孢桿菌；edeB基因；原核表達；轉錄時相；轉錄組

中圖分類號：Q939.96? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.02.006

Cloning， Prokaryotic Expression and Transcription Profile Analysis of edeB Gene in Brevibacillus brevis X23

DU Jie 1， CAI Hailin2， HUANG Binbin1， HUANG Jun1， ZHANG Cuiyang1， LONG Qingshan 1，

ZHANG Liang3， CHEN Hairong1， TANG Bingxuan1， CHEN Wu 3*， LIU Qingshu 1*

（1. Hunan Provincial Engineering and Technology Research Center for Agricultural Microbiology Application， Hunan Institute of Microbiology， Changsha 410009， China; 2. Changsha Tobacco Company of Hunan Province， Changsha 410011， China;

3. College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China）

Abstract： Brevibacillus brevis X23 can produce non-ribosomal antibiotic edeines， which have been widely used in biological control of plant diseases. The edeB gene in the edeine biosynthetic gene cluster regulates the synthesis of edeines. In this study， the prokaryotic expression vector pET28a-edeB was constructed by homologous recombination technology with edeB gene as the recombinant fragment of exogenous gene， and was transformed into Escherichia coli BL21（DE） for induced expression. The transcription profile of edeB gene in different culture times （12， 18， 24， 30 and 36 h） of B. brevis was detected by transcriptome sequencing. The results showed that the edeB gene was 771 bp in length， encoding 256 amino acids. SDS-PAGE electrophoresis showed that a specific band with a molecular weight of 30 kD appeared， which is in consistent with the bioinformatics prediction results. EdeB protein mainly existed in the form of inclusion bodies. The results of transcription profile showed that edeB gene was expressed at all culture times， and the gene expression showed a pattern of increasing at first and then decreasing with a peak at 30 h. These results laid a foundation for further study on the molecular mechanism of edeB gene regulating the synthesis of edeines， and provided a theoretical basis for the construction of high-yield edeine strains of B. brevis.

Key words： Brevibacillus brevis; edeB gene; prokaryotic expression; transcription profile; transcriptome

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（2）： 146-152）

短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）是一類革蘭陽性菌，呈桿狀，產芽孢，不產生毒素，對環境安全［1］。短短芽孢桿菌在植物病害生物防治、污染物降解和重金屬修復等領域的應用均有報道。由于能產生多種抗菌活性物質，其已成為用于植物病害生物防治方面的重要菌株［2-5］。

短短芽孢桿菌X23為本課題組從茄科作物根際土壤中分離篩選到的生防菌株。該菌對由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的茄科作物青枯病防治效果突出，已作為茄科作物青枯病生防菌得到大面積的推廣應用［6-9］。短短芽孢桿菌X23能產生具有廣譜抗菌活性的非核糖體肽類抗生素伊短菌素（edeines）。伊短菌素活性突出，抑菌譜廣，可很好地抑制細菌、真菌、支原體以及腫瘤細胞的生長，在農業生產和生物醫藥等領域具有廣泛的應用前景［10-13］。2012年，短短芽孢桿菌X23的基因組測序完成（GenBank ID：CP023474.1），利用antiSMASH軟件分析基因組數據發現，該菌株含有伊短菌素合成基因簇 ［14-15］。通過對伊短菌素基因簇進行敲除，驗證了該基因簇負責伊短菌素的生物合成，并通過原位啟動子工程改造獲得了將伊短菌素的產量提高8倍的短短芽孢桿菌工程菌［16］。為進一步提高伊短菌素的產量，人們對伊短菌素生物合成基因簇進行了生物信息學分析，結果表明： edeB是伊短菌素合成基因簇的重要調控基因，其編碼蛋白EdeB為ParB蛋白家族成員，分子質量為30.42 kD，理論等電點（pI）為6.23；該蛋白為親水性蛋白質，無信號肽和跨膜螺旋區，其二級結構的主要形式為α螺旋和無規卷曲，并且含有16個磷酸化位點、1個N-糖基化位點和20個O-糖基化位點［17］?；蚯贸突蚧匮a試驗表明，edeB在伊短菌素的生物合成過程中起著正調控作用，此外，過表達edeB基因可顯著提高短短芽孢桿菌X23中伊短菌素的產量［18］。本研究以短短芽孢桿菌X23基因組為材料，通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）獲得edeB基因，利用基因同源重組技術構建edeB基因的原核表達載體，進行EdeB蛋白原核表達和純化，并通過轉錄組測序研究edeB基因的轉錄時相。這將有助于深入研究edeB基因在短短芽孢桿菌生防應用中的功能及探究其調控伊短菌素合成的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

短短芽孢桿菌X23由湖南農業大學植保學院分離并保藏；質粒pET28a、大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞和GB05-dir由湖南省微生物研究院保藏。

1.1.2 培養基

肉湯培養基（Luria-Bertani medium，LB）（胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、NaCl 1.0 g、水1 000 mL，pH 7.0～7.5，固體培養基則添加1.5%的瓊脂粉）用于短短芽孢桿菌X23、大腸桿菌BL21（DE3）和GB05-dir的培養。

1.1.3 主要試劑

高保真DNA聚合酶PrimerSTAR Max DNA Polymerase及DNA分子量標準購自寶生物工程（大連）有限公司；限制性內切酶Xba I和Xho I購自英國NEB公司；Ni-NTA鎳柱購自GIAGEN公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）和卡那霉素均購自生工生物工程公司（上海）；基因組DNA提取試劑盒、質粒DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 短短芽孢桿菌X23基因組的提取

從-80℃超低溫冰箱中取出短短芽孢桿菌X23菌種涂板活化，挑取單菌落接種至裝有10 mL LB液體培養基的三角瓶中，37℃、180 r/min恒溫震蕩培養12～16 h，使用基因組DNA提取試劑盒提取短短芽孢桿菌X23的基因組DNA。

1.2.2 edeB基因的擴增與表達質粒的構建

參照短短芽孢桿菌X23基因組中edeB基因序列設計1對特異性引物，引物序列如下。edeB-F：5'-CCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAA

GAAGGAGATATACCATGTACGATGTGCTGGCAAATCTA-3'；edeB-R：5'-GGGCTTTGTTAGCA

GCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCG

AGTCGCATCGCACATATACACG-3'。以短短芽孢桿菌X23的基因組為模板，應用PrimerSTAR Max DNA Polymerase進行擴增，反應條件為：94℃預變性4 min；98℃ 30 s；58℃ 40 s; 58℃ 20 s；72℃ 20 s；共35個循環；72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化。載體pET28a經Xba I和Xhol I雙酶切處理后純化回收，并與edeB純化DNA片段混合；采用基因同源重組的方法電擊轉入含有重組系統的大腸桿菌GB05-dir；提取質粒，進行Xba I和Xhol I雙酶切驗證和測序，確認目的基因正確后插入載體，將重組質粒命名為pET28a-edeB。

1.2.3 EdeB蛋白的表達及純化

將重組質粒pET28a-edeB轉化至感受態細胞BL21（DE3）中，挑取單菌落過夜培養，按照體積比1：100轉入50 mL LB培養基中，37℃培養2.5 h，OD600 nm達到0.5左右后加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG，在16℃下誘導表達36 h，9 000 r/min離心5 min后收集菌體， 磷酸緩沖液（phosphate belanced solution，PBS）洗滌2次后超聲破碎30 min，9 000 r/min離心10 min。收集上清并用Ni-NTA瓊脂糖鎳柱進行蛋白純化，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate poly acrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析檢測EdeB蛋白的表達情況。

1.2.4 EdeB蛋白系統進化關系分析

在NCBI數據庫中檢索并下載波特氏短芽孢桿菌（Brevibacillus porteri）、強壯短芽孢桿菌（Brevibacillus fortis）、藻渣膨脹芽孢桿菌（Tumebacillus algifaecis）、土壤短芽孢桿菌（Brevibacillus agri）、熱紅短芽胞桿菌（Brevibacillus thermoruber）、溶短芽孢桿菌（Brevibacillus dissolubilis）、棲深海多分枝霉菌（Polycladomyces abyssicola）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、克里布所島津氏菌（Shimazuella kribbensis）、大豆白驊菌（Baia soyae）和解甘露聚糖熱堿芽孢桿菌（Caldalkalibacillus mannanilyticus）共11種微生物的ParB家族蛋白。使用MEGA7.0軟件，通過鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建EdeB蛋白與以上11種微生物ParB家族蛋白的系統進化樹，自舉檢驗值（bootstrap）設定為1 000，其余參數設置為默認。

1.2.5 短短芽孢桿菌edeB基因的轉錄時相分析

短短芽孢桿菌X23轉錄組測序的時間點分別為LB液體培養基培養12、18、24、30和36 h。將離心收集的菌體迅速轉入–80℃的冰箱中保存，參照產品說明書提取總RNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品總RNA的純度及完整性，用分光光度計（NanoDrop ND2 000）進一步檢測RNA濃度和OD260 nm/OD280 nm、OD260 nm/OD230 nm。轉錄組測序由深圳華大基因科技有限公司完成。從轉錄組數據中提取edeB基因的FPKM表達數據，利用TBtools軟件［19］進行基因表達熱圖分析。

2 結果與分析

2.1 edeB基因的序列分析及克隆

edeB基因全長為771 bp，其編碼蛋白有256個氨基酸（GeneBank ID：ATF13884.1）（圖1）。提取短短芽孢桿菌X23基因組，以其為模板，通過PCR擴增獲得edeB全長基因，經瓊脂糖凝膠電泳檢測可知，長度與預期相符（圖2a）。利用基因重組技術將edeB基因片段連接于pET28a質粒載體后，提取重組質粒進行Xba I和Xhol I雙酶切驗證（圖2b），經測序驗證后將重組質粒命名為pET28a-edeB，并轉化E. coil BL21（DE3）構建表達菌株。

2.2 EdeB蛋白誘導表達與純化

pET28a-edeB重組菌經IPTG誘導表達后，通過SDS-PAGE電泳檢測分析蛋白表達情況。結果表明，誘導前無特異條帶，誘導后菌體破碎離心分離得到的上清液和沉淀均在30 kD附近出現單一特異條帶，而且沉淀中條帶顏色較深，表明EdeB蛋白主要以包涵體的形式存在。對原核表達的EdeB蛋白純化后在30 kD處有一清晰的條帶，與預期蛋白質的大小吻合（圖3）。

2.3 EdeB蛋白的系統進化樹分析

為探究短短芽孢桿菌X23中EdeB蛋白與其他微生物ParB家族蛋白之間的親緣關系，本文對EdeB與11種微生物的ParB家族蛋白進行系統發育分析，利用MEGA7.0構建NJ進化樹（圖4）。系統進化樹結果表明，EdeB蛋白與波特氏短芽孢桿菌（Brevibacillus porteri）ParB蛋白的親緣性最高，與解甘露聚糖熱堿芽孢桿菌（Caldalkalibacillus mannanilyticus）ParB蛋白的親緣性最低。

2.4 短短芽孢桿菌edeB基因的轉錄時相分析

利用轉錄組測序對edeB基因在短短芽孢桿菌不同培養時間（12、18、24、30和36 h）的轉錄時相進行分析，結果表明，在所有培養時間點edeB基因均有表達，但表達情況具有明顯差異，其中，edeB基因在30 h表達量最高，在36 h表達量最低，基因表達模式呈現先升高后降低的趨勢（圖5）。由此可推測，短短芽孢桿菌edeB基因的轉錄時相可能與伊短菌素的合成積累過程有關。

3 討論

短短芽孢桿菌屬于革蘭陽性菌，主要分布在土壤中，隨著基因測序技術的發展，其新種陸續被發現，其中大多數都有重要的生物學意義，且具有廣泛的生防潛力，可作為微生物菌劑和植物保鮮劑等［20］。據報道，短短芽孢桿菌可產生多種抗菌物質抑制病原菌的生長。例如：2002年，Sheng等［21］分離到一株可有效防治蔬菜病原霉菌的短短芽孢桿菌No.G1，其可產生具有超高熱穩定性和抑菌能力的幾丁質內切酶；2014年，楊廷雅等［22］分離到一株可抑制芒果炭疽菌的短短芽孢桿菌HAB-5，發現其可產生大小約為14.4 kD的抑菌蛋白。

短短芽孢桿菌X23是在茄科作物根際土壤中分離到的廣譜拮抗細菌，大田試驗對煙草（Nicotiana tabacum L.）青枯病的平均防治效果達到85%以上，作為茄科作物青枯病生防菌劑的主要組成菌株已經得到大面積推廣［23-26］。edeB基因是短短芽孢桿菌X23伊短菌素合成基因簇中的調控基因。保守結構域分析表明，其編碼的EdeB蛋白為ParB家族的一員，可以通過蛋白質-DNA結合方式發揮調控作用。

ParB家族蛋白已經在許多微生物中被鑒定出。該家族蛋白又稱質粒主動分配蛋白，主要參與質粒和染色體的分配過程，具有DNA結合活性［27］。越來越多的研究表明，一些ParB家族蛋白不僅參與了質粒的分離，還參與了轉錄活性的調節，在各種細胞生物進程中發揮著重要的調控作用［28］。EdeB蛋白含有ParB家族結合DNA的典型HTH結構域，表明其可作為伊短菌素合成基因簇中的轉錄調控因子發揮調控伊短菌素合成的作用。雖然ParB家族蛋白廣泛存在于短短芽孢桿菌中，但是這類蛋白參與調控抗生素生物合成的分子機制尚待進一步研究。

本研究成功克隆獲得了edeB基因，構建了原核表達載體對EdeB蛋白進行誘導表達，并對edeB基因序列特征和轉錄時相進行了分析，為進一步研究edeB基因在調控短短芽孢桿菌伊短菌素合成積累的分子機制及其功能奠定了基礎，以期為利用分子生物學手段提高短短芽孢桿菌伊短菌素的產量、篩選獲得高產菌株提供有益的參考。

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收稿日期：2023-02-07；修回日期：2023-03-02。

基金項目：長沙市自然科學基金項目（kq2208130）；國家自然科學基金項目（32000047）；湖南省技術攻關“揭榜掛帥”項目（2021NK1040）；湖南省煙草公司長沙市公司科技項目（CS2022KJ02）。

作者簡介：杜杰，助理研究員，主要從事微生物分子遺傳與功能基因組學的研究。

* 通信作者：劉清術，研究員，主要從事微生物分子生物學的研究，E-mail： liuqingshu2012@126.com；? 陳武，副教授，主要從事作物土傳病害生物防控研究，E-mail： chenwuworrior@163.com。