基于HA修飾的CoFeO-TiO納米顆粒體外PDT滅活HL60細胞的試驗研究

潘綺琳 李淼淼 肖睦滄 艾保全 熊建文

摘 要：通過水熱法和表面修飾法制備了以CoFe2O4為內核、TiO2為外殼、用透明質酸修飾的HA@CoFe2O4-TiO2。利用場發射掃描電子顯微鏡（SEM）成像、能譜分析（EDS）、X射線衍射（XRD）、X射線光電子譜（XPS）、紫外-可見吸收光譜（UV-Vis）以及傅里葉變換紅外光譜（FTIR）對復合納米顆粒的理化性質進行表征。用細胞計數試劑（CCK-8）法研究HA@CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒在暗室條件下對白血病HL60細胞的毒性，以及在光照條件下的光動力療法（PDT）滅活效果。結合復合納米顆粒的熒光光譜（FS）、細胞內活性氧（ROS）產量和攝取納米顆粒水平分析，初步探究CoFe2O4和透明質酸與TiO2結合影響PDT滅活HL60細胞的作用機制。試驗結果表明，HA@CoFe2O4-TiO2形貌規則呈球形，尺寸符合細胞攝取要求。CoFe2O4拓寬了TiO2的可見光響應范圍。暗毒性試驗表明，HA@CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒對HL60細胞的毒性較小。同時，與TiO2和CoFe2O4-TiO2納米顆粒相比，HA@CoFe2O4-TiO2對HL60細胞的光動力滅活效率高達82.6%，表明其有望成為應用于體外PDT治療白血病的光敏劑，提高光動力效率及靶向性。

關鍵詞：CoFe2O4-TiO2；透明質酸；光動力療法；可見光；HL60細胞

中圖分類號：R454.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.02.004

An Experimental Study Based on HA Modified CoFe2O4-TiO2 Nanoparticles by Photodynamic Therapy for HL60 Cells in vitro

PAN Qilin， LI Miaomiao， XIAO Mucang， AI Baoquan， XIONG Jianwen*

（School of Physics and Telecommunication Engineering， South China Normal University， Guangzhou 510006， China）

Abstract： In this study， CoFe2O4-TiO2 was prepared by hydrothermal method， in which CoFe2O4 was the core and TiO2 was the shell， and HA@CoFe2O4-TiO2 was obtained by hyaluronic acid modification. The physicochemical properties of the nanocomposites were characterized by scanning electron microscopy （SEM） imaging， energy dispersive spectroscopy （EDS）， X-ray diffraction （XRD）， X-ray photoelectron spectroscopy （XPS）， ultraviolet-visible absorption spectroscopy （UV-Vis） and Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR）. CCK-8 method was used to investigate the toxicity of HA@CoFe2O4-TiO2 nanocomposites on HL60 cells in dark chamber， and the inactivation effect of photodymanic therapy （PDT）. The mechanism of interaction between CoFe2O4， hyaluronic acid and TiO2 on PDT inactivation of HL60 cells was preliminarily investigated by fluorescence spectra （FS）， intracellular ROS production and uptake level analysis of nanocomposites. The experimental results showed that the morphology of HA@CoFe2O4-TiO2 was regular and spherical， and the size met the requirements of cell uptake. The visible response range of TiO2 was broadened with CoFe2O4. Dark toxicity experiment proved that HA@CoFe2O4-TiO2 nanocomposites were less toxic to HL60 cells under darkroom conditions. Meanwhile， Compared with the groups treated with TiO2 and CoFe2O4-TiO2 nanoparticles， the photocatalytic inactivation efficiency of the group treated with HA@CoFe2O4-TiO2 was as high as 82.6%. Therefore， it has the potential to become a photosensitizer for the PDT treatment of leukemia in vitro， improving photodynamic efficiency and targeting.

Key words： CoFe2O4-TiO2; hyaluronic acid; photodynamic therapy; visible light; HL60 cells

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（2）： 126-138）

白血病是一種由造血干細胞惡性克隆引起的血液系統惡性腫瘤，嚴重影響造血系統的正常功能［1］。化學療法、放射療法、分子靶向療法、免疫治療、造血干細胞移植等是治療各類白血病最常見的治療策略，但它們也面臨著一些嚴峻的挑戰［2］。光動力療法（photodynamic therapy，PDT）是一種基于使用光敏劑（photosensitizer，PS）的非侵入性治療策略。這種光敏劑可以在腫瘤組織上積聚，并可以被特定波長的光源激活，在內源性分子氧存在的情況下形成具有細胞毒性的活性氧（reactive oxygen species，ROS），通過破壞細胞膜對微生物和靶組織產生不可逆的損傷，導致細胞壞死或凋亡［3］。PDT是一種有效的癌癥治療方式，可替代放療和化療，被廣泛用于癌癥治療的研究。

PDT系統的核心材料是光敏劑，它吸收光能轉化為治療因子或物質［4］。二氧化鈦納米顆粒（TiO2 NPs）在各種生物應用，如藥物傳遞等方面具有巨大的潛力，具有獨特的光催化特性、成本低、易合成、低毒等優點，是一種具有潛力的PDT治療藥物［5-6］。然而，由于銳鈦礦相TiO2具有較寬的能量帶隙（3.2 eV），光誘導載流子的自發復合率高，導致其可見光響應效率不高，限制了TiO2 NPs的應用［7-9］。有研究表明，TiO2可與其他窄帶隙半導體形成異質結結構，能有效提高光催化劑的光生載流子的分離和光催化效率［10-11］。尖晶石結構的鈷鐵氧體（CoFe2O4）具有可見光響應的光催化活性，帶隙窄，低毒，與TiO2結合可以使復合納米顆粒的光響應范圍拓展到可見光區［12］。然而，到目前為止，利用銳鈦礦相TiO2包裹CoFe2O4設計核-殼型異質結光敏劑的研究較少，且CoFe2O4-TiO2對癌細胞缺乏特異性識別能力。受體介導的抗癌藥物攝取可以作為白血病治療的一種有效的藥物傳遞系統［13］。CD44受體在HL60細胞表面高表達［14-16］。有研究發現，透明質酸（hyaluronicacid，HA）是一種天然多糖，具有生物相容性、可生物降解性和無毒性，對CD44受體有很強的親和力［17-19］。

本研究采用水熱法制備得到了CoFe2O4-TiO2的復合納米顆粒，其中CoFe2O4為內核，TiO2為外殼，并且用HA修飾制得HA@CoFe2O4-TiO2。通過探究TiO2、不同摩爾比的CoFe2O4-TiO2、HA@CoFe2O4-TiO2對HL60細胞的體外PDT滅活效果，分析CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒、HA修飾納米顆粒對HL60細胞的作用效果及機理，驗證HA@CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒應用于體外PDT治療白血病的光敏劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人早幼粒急性白血病細胞（HL60細胞）由中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所提供。

1.2 試劑及儀器

試劑：六水三氯化鐵（FeCl3·6H2O）、氯化鈷（六水合物，CoCl2·6H2O）、氫氧化鈉（NaOH）、無水乙醇（CH3CH2OH）、乙酰丙酮（C5H8O2）、鈦酸四丁酯（C16H36O4Ti）、25%氨水（NH3·H2O）、HA（C14H21NO11）n、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxy succinimide，NHS，C4H5NO3）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺［1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC，C8H17N3］、臺盼藍試劑（北京Biosharp）、細胞計數試劑（cell counting kit-8，CCK-8）（日本Dojindo）、RPMI-1604培養基（杭州四季青）、活性氧檢測試劑（北京普利萊）、磷酸緩沖液（phosphate buffer solution，PBS，美國Gibco）、醫用酒精（山東利爾康）、雙蒸餾水。

儀器：集熱式磁力加熱攪拌器（上海紅星）、SK2510LHC超聲儀（上海科導）、TG16-WS臺式高速離心機（湖南湘儀）、101-0A電熱鼓風干燥箱（北京永光明）、KSL-1400X-A2馬弗爐（合肥科晶）、MIRA4場發射掃描電子顯微鏡（捷克TESCAN）、X射線粉末衍射儀（德國Bruker）、X射線光電子能譜儀（日本島津）、WFY-28型熒光分光光度計（天津拓普）、UV-2600紫外可見分光光度計（日本Shimadzu）、PDT輻照室（自行設計）、XDS-1A倒置顯微鏡（廣東廣州）、超微振蕩器（姜堰新康）、酶標儀（美國Bio Rad）、CountessTM型自動細胞計數儀（美國Invitrogen）、TDL-50B低速離心機（上海安亭）、HH·CP-TW二氧化碳培養箱（上海一恒）、SW-CJ型潔凈工作臺（蘇州安泰）、移液槍（德國Eppendorf）、細胞計數板、96孔板。

1.3 試驗方法

1.3.1 HA@CoFe2O4-TiO2納米顆粒的制備方法

CoFe2O4的制備：取20 mmol（5.406 0 g）FeCl3·6H2O和10 mmol（2.379 4 g）CoCl2·6H2O加入50.00 mL去離子水中并攪拌，形成溶液A；再向溶液A中加入50.00 mL 2.4 mol/L NaOH溶液，并用磁力攪拌器攪拌30 min，形成前驅體，將溶液pH調至8。隨后，將前驅體轉移至對位聚苯（para polyphenyl，PPL）水熱合成高壓釜中，在200℃電熱鼓風干燥箱中反應8 h，冷卻后取出。最后用去離子水將產物洗滌3次，然后將其在60℃下干燥12 h，制得CoFe2O4。

CoFe2O4-TiO2的制備：將上述合成的CoFe2O4納米顆粒（0.386 g）分散在35.00 mL乙醇中，在超聲波（40 kHz，100 W）的作用下打散30 min。在磁力攪拌的作用下向溶液中加入4.00 mL乙酰丙酮和5.45 mL鈦酸四丁酯，緩慢加入35.00 mL去離子水和10.00 mL 25%氨水，將溶液轉移至高壓釜中180℃反應5 h。水熱反應后，用去離子水洗滌沉淀物3次，并在60℃下干燥12 h，隨后將其置于500℃的馬弗爐中，以5℃/min的加熱速率煅燒2 h，得到n（CoFe2O4）： n（TiO2）為0.1的復合納米顆粒CoFe2O4-TiO2，記為CT-0.1。重復上述試驗過程，改變鈦酸四丁酯的量（分別為2.80 mL、1.08 mL），制備得到n（CoFe2O4）： n（TiO2）分別為0.2和0.5的CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒，對應記為CT-0.2、CT-0.5。

HA@CoFe2O4-TiO2的制備：取0.1 g透明質酸、36.2 mg EDC和27.9 mg NHS溶于10.00 mL去離子水中攪拌4 h，以活化羧酸部分，形成溶液A。再取上述合成的CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒（CT-0.5，50.0 mg）溶于10.00 mL去離子水，形成5 mg/mL的CoFe2O4-TiO2溶液，并逐滴加入溶液A與活化的透明質酸反應20 h，通過高速離心得到透明質酸修飾的CoFe2O4-TiO2。隨后用去離子水洗滌產物3次，制得HA@CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒。

1.3.2 HA@CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒的表征

通過場發射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）表征復合納米顆粒的形貌和尺寸；使用能譜分析（energy dispersive spectroscopy，EDS）儀對復合納米顆粒的元素組成及含量進行分析；使用X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀對復合納米顆粒的結晶度和相純度進行研究；使用X射線光電子譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）對復合納米顆粒表面的化學狀態和元素組成進行分析；使用紫外可見分光光度計（ultraviolet-visible spectroscopy，UV-Vis）對復合納米顆粒的光響應范圍進行測定；使用熒光分光光度計對復合納米顆粒的電子空穴復合率進行分析；使用傅里葉變換紅外光譜（fourier transform infrared spectrometer，FTIR）對生物復合納米材料的官能團和化學鍵進行研究。

1.3.3 HL60細胞的培養與計數

將HL60細胞接種至含雙抗的10%新生牛血清的完全RPMI-1640培養基中，放置于37℃、5% CO2恒溫培養箱的托盤中進行培養。每隔24 h換液打散，使用移液槍取20 μL細胞懸浮液與臺盼藍染色液按照體積比1∶1的比例打散并混合均勻；取20 μL混合液加至細胞計數板的一個孔后迅速插入CountessTM型自動細胞計數儀中進行計數，取處于對數生長期的細胞進行試驗。

1.3.4 HA@CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒對HL60

細胞的暗毒性試驗與PDT試驗

在96孔培養板上規劃試驗，用CCK-8［20］檢測在無光照條件下和PDT輻照室中410 nm光照條件下的HL60細胞與各種不同質量濃度的復合納米顆粒共孵育后的細胞活性。取4個96孔培養板分別設置為光照組A、C板和遮光組B、D板，A、B板上設有對照組、試驗組以及調零組，每個試驗變量設置3個復孔，以減少試驗誤差。取對數生長期的HL60細胞制備細胞密度為2×105個/mL的細胞懸液。96孔板中的對照組中每孔接種100 μL細胞懸液和100 μL含雙抗、10%新生牛血清的完全RPMI-1640培養基；試驗組中每孔接種100 μL細胞懸液和100 μL不同質量濃度（20、40、80、160、200、320 μg/mL）的TiO2、CT-0.1、CT-0.2、CT-0.5、HA@CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒的溶液；調零組中每孔接種200 μL含雙抗、10%新生牛血清的完全RPMI-1640培養基。用微量振蕩器將96孔培養板內的細胞懸液和復合納米顆粒的溶液振蕩3 min，用75%醫用酒精拭擦消毒后置于CO2培養箱中進行避光培養12 h。取出光照組A、C板放入PDT輻照室中光照1 h，光照劑量為18 J/cm2，遮光組B、D板在CO2恒溫培養箱繼續進行避光培養。隨后向96孔板中每孔加入20 μL CCK-8，放置于CO2恒溫培養箱中繼續培養，每隔1 h使用iMarkTM酶標儀測定A、B板每孔的吸光度（optical density，OD）值，連續暗室條件下孵育4 h后，OD值接近1，停止培養。

利用公式（1）計算細胞的相對存活率：

R=×100%。（1）

式中R表示細胞相對存活率；ODtreat表示試驗組的OD值；ODcontrol表示對照組的OD值；ODblank

表示調零組的OD值。

利用公式（2）計算PDT滅活效率：

EPDT=（1-）×100%。（2）

式中EPDT為光動力滅活效率；ODirradiation表示光照組A、C板試驗組的OD值；ODblankA表示光照組A、C板調零組的OD值；ODwithout-irradiation表示遮光組B、D板試驗組的OD值；ODblankB表示遮光組B、D板調零組的OD值。

1.3.5 細胞內ROS檢測

熒光探針標記方法可檢測細胞內的ROS水平，具有較高的靈敏度、高分辨率、數據處理方便等優點［21-23］。取1.5 mL細胞密度為2×105個/mL的細胞懸液和1.5 mL質量濃度為320 μg/mL的不同的復合納米顆粒的溶液分別接種至6孔培養板中，在CO2恒溫培養箱中避光培養12 h。用培養基稀釋活性氧檢測試劑（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）至濃度為10 μmol/L，加入6孔板中，振蕩3 min混合均勻后放置于CO2恒溫培養箱中共孵育40 min。取出細胞液，離心，棄其上清，用PBS洗滌2次，將6孔培養板放入PDT輻照室中光照1 h，使用熒光分光光度計測量每孔溶液的熒光強度，激發波長為485 nm，發射峰約為525 nm。

1.3.6 細胞攝取納米顆粒的熒光檢測

用熒光光譜分析CoFe2O4-TiO2（CT-0.5）和HA@CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒的細胞攝取情況。取1.5 mL細胞密度為2×105個/mL的細胞懸液和1.5 mL質量濃度為320 μg/mL的不同復合納米顆粒溶液分別接種至6孔培養板中，振蕩3 min混合均勻后放置于CO2恒溫培養箱中共孵育12 h。取出6孔培養板，用PBS溶液洗滌細胞3次，去除未進入細胞的復合納米顆粒。最后使用熒光分光光度計，在激發波長為410 nm條件下測試每孔溶液的熒光強度，可以間接反映細胞攝取納米顆粒后的濃度，與攝取前納米顆粒溶液的熒光強度進行對比。

1.3.7 數據處理與分析

測試數據使用SPSS 26.0軟件分析顯著性差異，進行單因素方差分析（one-way ANOVA）。使用Origin 8.5軟件進行作圖，數據結果表示為3個重復試驗孔的平均值±標準差（x±s）。在所有的統計分析中，P<0.05被認為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 復合納米顆粒的表征

2.1.1 SEM成像和EDS分析

CoFe2O4、CoFe2O4-TiO2（CT-0.5）、HA@CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒的SEM圖像如圖1a、1d和1g所示，其中CoFe2O4和CoFe2O4-TiO2納米顆粒均呈球形，表面形貌規則。由圖1a可見，CoFe2O4納米顆粒粒徑較小，但有部分團聚的現象。圖1d為TiO2包裹CoFe2O4形成的CoFe2O4-TiO2，納米顆粒尺寸雖然增大，但是改善了納米顆粒的團聚現象，粒徑分布均勻。圖1g為CoFe2O4-TiO2經HA修飾形成的HA@CoFe2O4-TiO2，分散性較好。利用Nano Measurer 1.2軟件計算出納米顆粒的粒徑，其粒徑分布統計圖分別如圖1b、1e和1h所示，CoFe2O4、CoFe2O4-TiO2（CT-0.5）和HA@CoFe2O4-TiO2的平均粒徑分別約為39.17、55.99和71.17 nm。CoFe2O4、CoFe2O4-TiO2（CT-0.5）和HA@CoFe2O4-TiO2納米顆粒的粒徑均小于100 nm，能被細胞攝取。

CoFe2O4、CoFe2O4-TiO2（CT-0.5）和HA@CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒的EDS分析如圖1c、1f和1i所示。圖1c可見O、Fe、Co的元素峰，Co和Fe的原子百分數分別為19.12%和42.18%，Co和Fe的原子比約為1∶2，表明CoFe2O4納米顆粒已成功制備，且無其他雜質元素。圖1f中O、Fe、Co、Ti的元素峰表明CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒已有效合成，Co、Fe、Ti的原子百分數分別為11.06%、23.50%、29.45%，與CT-0.5的理論值一致，說明在CoFe2O4表面用TiO2包裹形成的CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒為CT-0.5。圖1i中多了C的元素峰，表明存在有機物HA。此外，C、O、Ti、Fe、Co的質量分數分別為25.88%，17.37%、22.90%、21.31%、12.55%，且無其他雜質元素。

2.1.2 XRD圖譜分析

本研究利用XRD研究了樣品TiO2、CT-0.1、CT-0.2、CT-0.5、CoFe2O4的結晶度和相純度，結果如圖2所示。CT-0.1、CT-0.2、CT-0.5均在2θ為18.12°、30.20°、35.54°、43.19°、57.35°、62.58°時出現CoFe2O4的衍射峰，分別對應于尖晶石型的（111）、（220）、（311）、（400）、（422）、（440）晶面的衍射峰［24-25］；同時在2θ為25.39°、37.89°、48.18°、53.98°、55.19°、62.85°、68.96°、70.35°、75.25°時出現TiO2的衍射峰分別對應于銳鈦礦型的（101）、（004）、（200）、（105）、（211）、（204）、（116）、（220）、（215）晶面的衍射峰［26］。在TiO2、CoFe2O4、CoFe2O4-TiO2的圖譜中沒有觀察到任何雜質的存在，表明所制得的樣品純度較高。另外，TiO2、CoFe2O4-TiO2經過高溫煅燒后結晶度較CoFe2O4高。在XRD圖譜的基礎上，利用Debye-Scherrer公式［27］估算了樣品的平均晶粒尺寸D：

D=（3）

其中，K為常數0.89，λ為輻射波長（λCu =1.541 78 ?），θ為布拉格角，β為半波峰全寬（full width at half maxima，FWHM）。TiO2、CoFe2O4、CT-0.1、CT-0.2、CT-0.5的平均晶粒尺寸分別為22.0、19.0、42.9、41.4、28.3 nm，所得結果略小于SEM圖測得的水合粒徑。

2.1.3 XPS分析

圖3為CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒的XPS。圖3a顯示，284.8、456.0、528.0、709.0和778.0 eV的結合能分別屬于C 1s、Ti 2p、O 1s、Fe 2p和Co 2p。在這些特征峰中，C 1s來自于吸附在樣品表面的空氣中的CO2。用C 1s（284.8 eV）［28］進行標定，各元素的高分辨率光譜如圖3b～3e所示。

Co 2p的高分辨率光譜在780.26和796.15 eV處出現兩個峰，分別對應于Co 2p3/2和Co 2p1/2態；此外，位于785.06和802.55 eV的衛星峰分別對應于尖晶石體系八面體和四面體位點Co2+的氧化態［29］。Fe 2p的高分辨率光譜在Fe 2p3/2和Fe 2p1/2主峰上各有兩個自旋軌道分裂雙峰，表明Fe3+離子存在于兩個不同的點陣位置，與立方尖晶石型晶體結構的預期一致，結合能在710.43和724.16 eV處歸因于八面體中的Fe3+，在712.65和726.74 eV處歸因于四面體中的Fe3+，在718.72和733.34 eV處的峰為振蕩衛星峰［30］。O 1s的高分辨率光譜在529.77、531.02和532.98 eV處出現特征峰，分別對應于TiO2和CoFe2O4中的Co-O-Fe橋接鍵、TiO2表面吸附水末端的-OH鍵（Ti-OH）和TiO2的晶格氧空位（Ov），這種氧缺陷的現象可能歸因于合成過程中形成的Ti3+。Ti 2p的高分辨率光譜在458.58和464.44 eV處出現兩個峰，分別對應于TiO2中Ti4+的Ti 2p3/2和Ti 2p1/2態；在459.49 eV處出現的峰對應于Ti2O3中的Ti3+。TiO2表面的Ti4+和Ti3+表明，溶劑熱反應過程中會形成大量的氧空位Ov，氧化態較低的Ti3+證實了氧缺陷。Ti3+的存在通過創造新的中隙態增加了光催化活性［31］。

2.1.4 UV-Vis分析

TiO2、CoFe2O4、CT-0.1、CT-0.2和CT-0.5復合納米顆粒的UV-Vis吸收光譜如圖4a所示。TiO2在400 nm波段以下的紫外光區吸收較強，而CoFe2O4的光吸收范圍沿可見光區域擴展，在近紅外光區吸收逐漸減弱。CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒的光譜也有較寬的吸收范圍，從紫外光區擴展到可見光區，表明與純TiO2相比，TiO2由于與CoFe2O4相偶聯而發生紅移。CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒在410 nm的可見光區吸收較強，TiO2、CoFe2O4、CT-0.1、CT-0.2和CT-0.5復合納米顆粒對可見光410 nm波段的吸收值分別為0.059、1.347、0.938、1.043和1.177。有類似的研究發現，CoFe2O4-TiO2光吸收的增加是由于在鈦氧化物晶格結構中，Fe3+（0.64 ?）或Co2+（0.65 ?）取代了一些Ti4+（0.68 ?）離子，這種離子取代意味著TiO2的電子結構發生了改變，Fe3+/Co2+修飾成為價帶（valence band，VB）或導帶（conduction band，CB）之間的一個新的雜質能級，縮小了原有的帶隙，增強了可見光的響應范圍［32］。本試驗光動力輻照室中LED陣列光源的發射光譜如圖4b所示，發射峰為409.54 nm，能有效激發CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒，從而進行PDT試驗。

2.1.5 FTIR分析

圖5a為納米顆粒的FTIR。在CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒的FTIR（曲線a）中出現了759、1 634、3 357 cm–1的吸收峰，位于759 cm–1的吸收峰對應于O-Ti-O鍵的振動［33］，在1 634和3 357 cm-1的吸收峰歸因于表面殼層銳鈦礦TiO2的羥基（-OH）的彎曲振動和伸縮振動［34］。

在HA的FTIR（曲線b）中，1 032 cm–1的吸收峰是由于環狀酸酐的C-O-C伸縮振動引起的，1 321和1 375 cm–1處的峰對應于羧酸基團的特征峰，1 406 cm–1的吸收峰是由N-乙酰氨基的C-N鍵對稱伸縮振動引起的，在1 606 cm–1的吸收峰歸因于羧酸基團的酰胺（-CO-NH-）中C=O的反對稱伸縮振動［35］，在2 896 cm–1處表示醛基的飽和碳原子上的C-H基團的振動峰，處于3 289 cm–1的吸收峰歸因于締合態OH的伸縮振動［36］。

在HA@CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒的FTIR（曲線c）中，位于761 cm–1的吸收峰對應于CoFe2O4-TiO2中O-Ti-O鍵的振動；當HA與CoFe2O4-TiO2結合時，峰值移到了1 630 cm–1處，表明HA的游離羧酸基團參與了CoFe2O4-TiO2殼層羥基的鍵合；與CoFe2O4-TiO2的FTIR相比，羥基（-OH）的伸縮振動吸收峰向低波數方向移到了3 244 cm–1處，是羥基化合物產生的締合現象［37］；在1 406和2 896 cm–1處出現N-乙酰氨基和D-葡萄糖醛酸的特征峰表明，HA被成功地包覆在了CoFe2O4-TiO2表面。

HA的分子結構如圖5b所示，是由β-1，4-D-葡萄糖醛酸-β-1，3-N-乙酰-D-葡糖胺的重復雙糖單元組成的線性陰離子聚合物，其含有羧酸、羥基和N-乙酰氨基，很容易與其他化學物質結合［38］。HA分子中含有大量的羧基，而CoFe2O4-TiO2外殼含有豐富的羥基。綜合上述FTIR可知，HA通過其羧酸基團與CoFe2O4-TiO2的殼層表面的羥基以酯化反應的形式結合。

2.2 細胞試驗

2.2.1 CoFe2O4-TiO2、HA@CoFe2O4-TiO2納米顆粒對HL60細胞的暗毒性試驗

圖6顯示了不同質量濃度與不同摩爾比的CoFe2O4-TiO2、HA@CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒孵育12 h后HL60細胞的活力。可以看出，隨著納米顆粒質量濃度的增加，細胞活力降低。此外，在低質量濃度（小于150 μg/mL）的納米顆粒孵育后，細胞活力沒有受到納米顆粒的顯著影響。然而，當CT-0.5納米顆粒質量濃度增加到較高濃度200 μg/mL和320 μg/mL時，HL60細胞的活力分別降低到（87.1±2.2）%和（86.6±1.7）%，這仍然是可以接受的。這表明，即使在相對高濃度的納米顆粒下，CoFe2O4-TiO2仍具有相對較低的細胞毒性。在納米顆粒質量濃度低于40 μg/mL時，HA@CoFe2O4-TiO2處理HL60細胞后的存活率高于CoFe2O4-TiO2，可能是由于在低濃度下，HL60細胞攝取復合納米顆粒的量是相同的，而經過透明質酸包裹后的CoFe2O4-TiO2可減少CoFe2O4暴露對細胞的損傷。當質量濃度達到320 μg/mL時，HA@CoFe2O4-TiO2處理后的細胞存活率為（82.0±1.5）%，仍然高于80%。

2.2.2 CoFe2O4-TiO2、HA@CoFe2O4-TiO2納米顆粒對HL60細胞的PDT體外滅活試驗

在光照條件下，TiO2、CT-0.1、CT-0.2、CT-0.5復合納米顆粒對HL60細胞的PDT滅活效率隨質量濃度變化的曲線如圖7所示。由圖可知，納米顆粒質量濃度增加，PDT效率會隨之提高。在相同質量濃度條件下，PDT滅活效率的高低依次是CT-0.5>CT-0.2>CT-0.1>TiO2，這說明，以CoFe2O4為內核、TiO2為殼層形成的CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒的PDT效率比TiO2高。當CoFe2O4與TiO2的摩爾比為1：2、質量濃度為320 μg/mL時，CT-0.5對HL60細胞的最佳PDT滅活效率為（78.3±1.8）%，而TiO2對HL60細胞的最佳PDT滅活效率為（52.6±2.9）%。CT-0.5復合納米顆粒同時具有較低的暗毒性和高光毒性。經過HA修飾后的HA@CoFe2O4-TiO2對白血病HL60細胞的可見光PDT滅活效率顯著提高。當質量濃度為320 μg/mL時，HA@CoFe2O4-TiO2對HL60細胞的最佳滅活效率為（82.6±1.3）%。

2.3 HA@CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒PDT體外滅活HL60細胞的機理分析

2.3.1 CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒熒光光譜分析

當光敏劑被特定波長光照射時，價帶上的電子因吸收足夠的入射光子能量被激發到高能級的導帶，而這個過程電子和空穴會復合導致發射熒光，發光的強度與電子空穴的復合率有關［39］，從而可以揭示載流子的壽命。如圖8所示，TiO2、CT-0.1、CT-0.2、CT-0.5復合納米顆粒的熒光強度依次降低，說明CoFe2O4的引入有效抑制了TiO2光生電子、空穴的復合，內核CoFe2O4與殼層TiO2之間發生了有效的電子轉移。CT-0.5復合納米顆粒的電子-空穴復合率最低，更多的電子、空穴參與光動力反應產生了ROS，進而提高了PDT效率。復合納米顆粒中電子空穴較低的復合率可能是由于納米復合材料結構中較高的雜質水平導致了非輻射型的復合。

2.3.2 活性氧水平分析

在癌癥的PDT中，光敏劑選擇性地在腫瘤組織中積累，被最佳波長的光激發后，光敏劑與周圍氧分子反應產生了具有細胞毒性的1O2和其他形式的ROS，導致細胞膜、線粒體或溶酶體損傷，最終通過凋亡或壞死導致細胞死亡［40］，因此，細胞內產生的ROS水平是評估光敏劑介導PDT滅活細胞的重要參數。使用熒光分光光度計測試活性氧探針DCFH-DA被氧化為2'，7'-二氯熒光素（2'，7'-dichlorofluorescein，DCF）的熒光強度，DCF的最大波峰在528 nm，其熒光強度的增強與ROS產量成正比。如圖9所示，經PDT處理后，CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒作用后細胞的綠色熒光強度顯著高于TiO2組，表明CoFe2O4-TiO2組的ROS產量顯著增加，即有更多的光生空穴、電子參與細胞內水和氧分子的氧化還原反應；CT-0.5復合納米顆粒處理后，細胞內的ROS產量最高，是TiO2組的1.9倍。此結果與PDT滅活效率結果一致，光照后光敏劑產生的ROS是PDT滅活HL60細胞的主要因素。HA@CoFe2O4-TiO2處理后的HL60細胞在光照1 h后，相比于CoFe2O4-TiO2能產生更多ROS，這可能是由于CoFe2O4-TiO2部分團聚，表面體積比變小，光照射到外殼TiO2的面積有限。而HA@CoFe2O4-TiO2顆粒表面的HA具有親水性，在水溶液中具有更好的分散性，表面體積比更大，吸收光效率更高，因此HA@CoFe2O4-TiO2產生的ROS含量更高。

2.3.3 細胞內攝取納米顆粒的水平分析

為了進一步證實HA可以促進靶細胞對HA@CoFe2O4-TiO2的特異性攝取，本研究采用熒光光譜分析HL60細胞對CoFe2O4-TiO2和HA@CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒的胞內攝取情況。圖10為原始組質量濃度為320 μg/mL的CoFe2O4-TiO2、HA@CoFe2O4-TiO2和攝取組經過12 h孵育后，被細胞吸收的納米顆粒產生的熒光強度。兩圖中a、b曲線的重疊程度可以反映HL60細胞對納米顆粒的吸收程度，與CoFe2O4-TiO2組相比，經過HA修飾后的HA@CoFe2O4-TiO2納米顆粒的攝取增加。

3 討論

TiO2具有較高的光生電子-空穴對復合率，因此生成的電子-空穴對只有一小部分可用于光催化反應。摻雜金屬或非金屬，或形成異質結結構能有效分離半導體光催化劑中的光生電子-空穴對，從而提高光催化效率。本研究的CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒是一種核殼異質結構，內核CoFe2O4為p型半導體，外殼TiO2為n型半導體，兩者形成了p-n異質結。TiO2的電子經過p-n界面擴散到CoFe2O4，留下帶正電的空穴（h+）；同時，CoFe2O4的空穴擴散到TiO2中，留下帶負電的電子（e-）。電子和空穴繼續擴散，CoFe2O4的EF位置升高，而TiO2的EF位置下降，直到CoFe2O4和TiO2的費米能級EF相等，達到熱平衡為止，最后在p-n界面中形成一個內部電場。CoFe2O4和TiO2能帶彎曲，CoFe2O4的整體能級上升，而TiO2的整體能級下降［12］。由于從n型半導體TiO2的導帶到p型半導體CoFe2O4的價帶形成的內部電場的影響，光照時，光生電子很容易從CoFe2O4的ECB轉移到TiO2的ECB，光生空穴從TiO2的高EVB轉移到CoFe2O4的低EVB。TiO2的eCB-可以將O2還原為O2·，而hVB+則可以將水氧化為羥基自由基（·OH）等ROS物質。電子的有效轉移延長了分離后載流子的壽命，并與細胞周圍環境的底物反應生成ROS。

本文主要研究了HA@CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒對HL60細胞的PDT滅活效果。采用水熱法制備了不同摩爾比的CoFe2O4-TiO2核殼結構復合納米顆粒。SEM分析表明，納米顆粒形貌規則呈球形，粒徑大小符合細胞攝取要求。XPS分析表明，氧化態較低的Ti3+的存在可能是由于溶劑熱反應過程中形成了大量的氧空位Ov。UV-Vis分析表明，CoFe2O4拓寬了TiO2的可見光響應范圍，對可見光吸收增強。使用HA對CT-0.5復合納米顆粒的表面進行修飾，FTIR分析表明，HA分子通過其羧基基團與CoFe2O4-TiO2的殼層表面的羥基以酯化反應的形式結合，使得HA修飾的納米顆粒對HL60細胞具有靶向性，也增強了CoFe2O4-TiO2可見光PDT滅活白血病HL60細胞的效率。暗毒性試驗表明，CoFe2O4-TiO2、HA@CoFe2O4-TiO2具有較低的暗毒性。對于CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒而言，CoFe2O4的存在導致Fe3+和Co2+離子的釋放，引起DNA損傷，造成一定的生物遺傳毒性。對于不同摩爾比的CoFe2O4-TiO2，TiO2外殼厚度越大，其對HL60細胞的毒性越低，在無光照條件下能減少CoFe2O4內核的暴露，起保護細胞的作用。由于在高質量濃度下，CoFe2O4-TiO2已達到細胞的最大攝取量，而HA@CoFe2O4-TiO2對HL60細胞的親和力越高，細胞對其攝取量越大，導致細胞存活率越低。這表明，HA的修飾提高了CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒的生物相容性。在光照條件下，CoFe2O4-TiO2的PDT滅活效果優于TiO2，其中CT-0.5對HL60細胞的最佳PDT滅活效率達到了（78.3±1.8）%。CoFe2O4的引入有效抑制了TiO2光生電子、空穴的復合，CoFe2O4-TiO2的電子-空穴復合率越低，納米顆粒表面產生的ROS越多，PDT效率越高。當納米顆粒的質量濃度高于200 μg/mL時，PDT效率增長趨勢變緩，這可能是由于納米顆粒的質量濃度較高，HL60細胞對納米顆粒的攝取達到了極限值。而經HA修飾形成的HA@CoFe2O4-TiO2對HL60細胞的親和力越高，細胞的攝取量越大，越多的復合納米顆粒參與光動力反應，因此，HA@CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒的PDT滅活HL60細胞的效率越高，最佳PDT滅活效率達到了（82.6±1.3）%。HA@CoFe2O4-TiO2很可能通過內吞作用被吸收，而CoFe2O4-TiO2則可能通過細胞膜自由擴散。已有大量研究表明，在許多白血病細胞如人急性髓系白血病細胞、HL60細胞表面的CD44受體過表達。CD44是HA的主要結合受體之一，負責HA與細胞表面相互作用［41］，表明HA@CoFe2O4-TiO2可以通過受體介導的內吞途徑被CD44受體過度表達的癌細胞特異性吸收，受體介導的內吞作用比非特異性結合（穿透過程）更有效。HL60細胞能靶向吸收更多的HA@CoFe2O4-TiO2復合納米顆粒，被可見光激發產生更多的電子、空穴參與細胞內水分子、氧氣的氧化還原反應，產生更多的ROS殺傷細胞，從而提高PDT滅活HL60細胞的效率。

本研究制備的HA@CoFe2O4-TiO2對白血病HL60細胞具有靶向性及較高的PDT滅活效率，有望成為應用于體外PDT治療白血病的光敏劑。但體內PDT滅活效果及對正常細胞是否有殺傷作用尚未探究。接下來將在活體內進行PDT滅活試驗，更好地了解HA@CoFe2O4-TiO2的體內命運，在細胞攝取后實現對藥物釋放的控制，以達到所需的藥效學效果。

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收稿日期：2023-01-09；修回日期：2023-02-04。

基金項目：國家自然科學基金項目（12075090）。

作者簡介：潘綺琳，碩士研究生。

* 通信作者：熊建文，教授，主要從事激光生物學和生物醫學光子學方面的研究。E-mail： jwxiong@scnu.edu.cn。