一種來源于蜘蛛毒液的新型Nav1.7多肽抑制劑的發現與鑒定

羅森 楊坤 李閩 肖文萱 雷偉 張紫萱 陳敏芝

摘 要：Nav1.7特異性地表達在外周傷害性感覺神經元。臨床遺傳學、動物模型和藥理學研究表明，Nav1.7是一個重要的鎮痛藥物開發靶點。本研究以溝紋硬皮地蛛（Calommata signata Karsch）毒液為研究對象，通過電刺激采集毒液、反相高效液相色譜分離純化、質譜鑒定、蛋白質測序以及全細胞膜片鉗記錄等方法，篩選并鑒定到一種對Nav1.7有抑制作用的新型多肽毒素，命名為APTX-1。質譜鑒定該多肽毒素的分子質量為7 815.2 Da；其N端前10位氨基酸序列為ASCKQVGEEC。APTX-1抑制Nav1.7電流具有濃度依賴性，其半數抑制濃度為（0.46±0.08） μmol/L。通道動力學分析顯示，APTX-1并不影響Nav1.7的翻轉電位、電壓依賴性穩態激活曲線和失活曲線，表明該多肽毒素并不影響Nav1.7的離子選擇性和電壓依賴性。綜上所述，本研究獲得了一個新型Nav1.7調制劑，并探究了其對Nav1.7的作用特點，為靶向Nav1.7的鎮痛藥物研發提供了潛在先導分子。

關鍵詞：溝紋硬皮地蛛；多肽毒素；Nav1.7；APTX-1；疼痛

中圖分類號：O629.72? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.02.005

Discovery and Identification of a Novel Nav1.7 Peptide Inhibitor from Spider Venom

LUO Sen#， YANG Kun#， LI Min， XIAO Wenxuan， LEI Wei， ZHANG Zixuan， CHEN Minzhi*

（The National and Local Joint Engineering Laboratory of Animal Peptide Drug Development，College of Life Sciences，Hunan Normal University，Changsha 410081，China）

Abstract： Voltage-gated sodium channel Nav1.7 is preferentially expressed in peripheral nociceptors. Clinical genetics，animal models and pharmacological studies indicate that Nav1.7 is an important target for analgesic drug development. In this paper，we report the isolation and characterization of APTX-1，a novel peptide toxin from the venom of spider Calommata signata Karsch. Patch-clamp analysis confirmed that APTX-1 potently inhibits the currents of Nav1.7. Mass spectrum results showed that the molecular weight of APTX-1 was 7 815.2 Da. The first 10 amino acid positions at the N terminal were ASCKQVGEEC. APTX-1 inhibited Nav1.7 currents in a concentration-dependent manner，with a half-inhibitory concentration of （0.46±0.08） μmol/L. Channel dynamics analysis showed that APTX-1 did not affect the reversal potential，voltage-dependent steady-state activation curve，and inactivation curve of Nav1.7，indicating that the peptide toxin did not affect the ion selectivity and voltage dependence of Nav1.7. In conclusion，we found a novel Nav1.7 peptide inhibitor，and the characteristics of its action on Nav1.7 were studied to provide lead molecules for the development of analgesic drugs targeting the Nav1.7.

Key words： Calommata signata Karsch; peptide toxin; Nav1.7; APTX-1; pain

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（2）： 139-145）

Nav1.7是一種電壓門控鈉離子通道（voltage-gated sodium channels，VGSCs），在人體內主要表達于外周神經系統，具有快速激活、快速失活和緩慢關閉狀態失活等特點，因此，其在動作電位中作為“閾值通道”影響動作電位爆發的閾值，在外周傷害感受器痛覺信號起始和傳導過程中發揮重要作用［1-3］。臨床遺傳學表明，Nav1.7功能獲得性突變會導致神經病理性疼痛，如先天性紅斑肢痛癥（inherited erythromelalgia，IEM）和陣發性極度疼痛障礙（paroxysmal extreme pain disorder，PEPD），而功能喪失性突變則會導致先天性無痛癥（congenital insensitivity to pain，CIP）［4-10］。因此，Nav1.7被認為是最具潛力的鎮痛藥物開發靶點之一。實際上，輝瑞、強生和默克等國際大型藥企早已針對Nav1.7的鎮痛藥物的研發進行了布局，目前已有多個Nav1.7的選擇性小分子抑制劑正處于臨床前或臨床試驗中。基于此，篩選和鑒定新型的Nav1.7抑制劑對靶向Nav1.7的鎮痛藥物開發具有重要的科學理論意義和臨床應用價值。

蜘蛛（Araneae）、蝎子（Scorpionida）等有毒動物的毒液中含有多種活性成分，其中主要為多肽毒素，大部分多肽毒素的肽鏈結構中含有多對二硫鍵，可以形成非常穩定的空間框架［11-12］。大量研究表明，這些多肽毒素對VGSCs具有高親和力和高選擇性，是有毒動物捕食和防御的分子武器，同時也是神經藥理學研究的有利分子工具和先導藥物分子［13-14］。然而，目前已研究的多肽毒素僅約總量的0.01%，蜘蛛多肽毒素的開發利用仍有巨大潛力［14］。

本研究以先前鮮見報道的溝紋硬皮地蛛（Calommata signata Karsch）毒液為研究對象，通過結合反相高效液相色譜、質譜鑒定、蛋白質測序和全細胞膜片鉗記錄等多種方法，成功篩選和鑒定到一種對Nav1.7有強抑制作用的新型多肽毒素APTX-1，為靶向Nav1.7的鎮痛藥物開發提供了潛在的先導分子。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

溝紋硬皮地蛛采集自四川省雙流縣的山區，置于細竹筒內運至湖南，室內人工飼養。將溝紋硬皮地蛛飼養于裝有椰土的塑料盒內，每周給水并喂以面包蟲（Tenebrio molitor）。采用直流脈沖式電刺激的方法每兩周采集毒液一次［15］。

1.1.2 藥物與試劑

三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA，色譜純）和乙腈（acetonitrile，ACN，色譜純）購自上海江萊生物科技有限公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸［α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid，CCA，色譜純］ 購自德國默克公司；胎牛血清、Dulbecco 改良的Eagle培養基（Dulbeccos modified Eagle medium，DMEM）、減血清培養基（Opti-MEMTM reduced serum medium）、胰蛋白酶以及LippofectamineTM 2000購自美國賽默飛世爾科技公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）購自于生工生物工程（上海）股份有限公司；全細胞膜片鉗記錄Nav1.7電流的細胞外液［150 mmol/L NaCl、1 mmol/L MgCl2、2 mmol/L KCl、1.5 mmol/L CaCl2、10 mmol/L 羥乙基哌嗪乙硫磺酸［4-（2-hydroxyethyl）piperazine-1-ethanesulfonic acid］，用NaOH調pH至7.4］，全細胞膜片鉗記錄Nav1.7電流的細胞內液［105 mmol/L CsF、10 mmol/L NaCl、10 mmol/L 乙二醇四乙酸（ethylene glycol tetraacetic acid，EGTA）、10 mmol/L HEPES，用CsOH調節pH至7.4］，用于膜片鉗記錄的內外液試劑，均購自德國默克公司。

1.1.3 材料與儀器

XXJ-3型蝎子提毒儀（石家莊蜂富生物科技）用于毒液采集；HPLC system高效液相色譜儀（美國沃特世公司）和C18反相柱 ［月旭科技（上海）股份有限公司］ 用于毒液的分離純化；5800基質輔助激光解吸/電離飛行時間串聯質譜儀（美國應用生物系統公司）用于多肽毒素的分子質量鑒定；PPSQ-51A蛋白質測序儀（日本島津公司）用于多肽毒素序列測定；EPC 10 USB雙通道膜片鉗放大器（德國HEKA公司）和PatchMaster膜片鉗數據采集軟件用于膜片鉗分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 溝紋硬皮地蛛毒液的采集與分離純化

通過蝎子提毒儀（參數為中等強度頻率，20 V電壓）采集溝紋硬皮地蛛毒液，并于-20℃保存。毒液用PBS稀釋100倍，于4℃條件下以10 000 r/min離心10 min后，取上清液進行色譜分離。使用高效液相色譜儀進行毒液分離純化，色譜柱采用C18反相柱（10 mm×250 mm，5 μm）。分離過程采用兩相洗脫系統。流動相：A液為含0.1% 三氟乙酸的雙蒸水；B液為含0.1% 三氟乙酸的乙腈。A、B液都通過加入高純度氦氣去除溶液中的空氣。進行分離時，上樣體積為100 μL。先用5%的B液平衡色譜柱5 min，然后再進行梯度洗脫。洗脫流速為1.0 mL/min，檢測波長為215 nm和280 nm，洗脫時柱溫為25℃。洗脫梯度依次為：0～5 min，10%的B液；5～55 min，10%～60%的B液；55～60 min，95%的B液；60～65 min，10%的B液。分別收集各洗脫峰，冷凍干燥后保存備用。

1.2.2 質譜鑒定

通過基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）對多肽毒素的分子質量進行鑒定，配制含有0.1% 三氟乙酸和50% 乙腈的飽和α-CCA溶液，超聲溶解后高速離心5～10 min，取上清液作為基質溶液。然后，取1 μL的待測樣品，與1 μL基質溶液按1∶1的體積比充分混合后點樣于金屬靶盤上，在室溫下自然干燥后上機檢測。

1.2.3 氨基酸序列測定

氨基酸序列測定在島津PPSQ-51A蛋白質測序儀上自動進行。用PTH C18柱通過LC20A對苯異內酰硫脲（phenylthiohydantoin，PTH）氨基酸進行反相高效液相色譜分析，通過與標準氨基酸色譜圖比較確定每個測定循環的氨基酸，從而得到測試樣品的氨基酸序列。

1.2.4 細胞傳代與轉染

采用含10%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素和1% L-谷氨酰胺的DMEM培養基培養HEK293T細胞（人胚胎腎細胞293T）。添加培養基后，將細胞置于37℃、含5% CO2的細胞培養箱內培養，每3 d進行1次傳代培養。

Nav1.7表達質粒是通過將編碼人源Nav1.7的cDNA序列亞克隆至pcDNA3.1（+）載體上構建而成的。利用陽離子脂質體載體LipofectamineTM 2000將Nav1.7表達質粒與增強的綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP）質粒瞬時轉染進入HEK293T細胞，培養約24 h，挑選有綠色熒光的細胞進行電生理試驗。

1.2.5 全細胞膜片鉗

本研究的電生理試驗均使用全細胞膜片鉗完成。試驗在室溫下進行。試驗前先將細胞培養基更換為1.5 mL的鈉離子通道細胞外液。記錄電極由玻璃電極經電極拉制儀兩步拉制而成。電極入水前給予一定的正壓，使電極尖端不易被堵塞，入水電阻以1.8～3.0 MΩ為宜。入水后進行液間電位補償，在顯微鏡下調節微操，使電極接近細胞。輕輕擠壓細胞，當電極電阻增加0.3 MΩ左右時停止。然后給予持續的負壓，當電極電阻上升至100.0～300.0 MΩ且不再增加時釋放負壓，待電阻阻值變為吉歐（GΩ）時，表示已建立高阻封接。進行快電容補償后調為全細胞模式，并給予-90 mV的鉗制電壓。向電極內部施加一個稍大于封接時的負壓，進行破膜。破膜后進行慢電容、串聯電阻（補償65%～70%）和漏電流補償，使電流曲線位于零位的基線處，等待4～5 min后進行電流記錄。記錄的Nav1.7電流經過3 kHz和10 kHz的雙重濾波過濾，采用P/4漏減去除漏電流。應用Patchmaster軟件進行電流的記錄和采集。試驗結果分析采用GraphPad Prism7.00軟件完成。數據均采用平均值±標準誤（x±sx）表示。

電生理試驗中，HEK293T細胞均被鉗制于-90 mV。在篩選Nav1.7調制組分、測定APTX-1對Nav1.7的半數抑制濃度的試驗中，使用持續時間為50 ms、電壓為-10 mV的方波電壓刺激記錄Nav1.7電流。為了測定APTX-1對Nav1.7電壓依賴性和穩態激活曲線的影響，本研究施加從-80 mV至+80 mV的一系列測試電壓，步階為 5 mV，持續時間為50 ms，各測試脈沖之間的時間間隔為5 s。取各電壓下的峰電流值繪制電流-電壓曲線。計算各電壓下的電導值G，繪制穩態激活曲線，公式為：G＝I/（V-Vrev），其中I為某一刺激電壓下的通道峰電流，Vrev為翻轉電位。采用雙脈沖刺激方式測定APTX-1對Nav1.7穩態失活曲線的影響。第一部分是一個持續時間為500 ms的方波，從-100 mV逐級遞增至+40 mV，作為條件脈沖誘導鈉通道失活；第二部分為一持續時間為50 ms的-10 mV去極化刺激，用于檢測通道失活后的剩余電流。

1.3 數據分析

1.3.1 抑制的濃度效應曲線分析

通過Hill常數方程擬合毒素抑制Nav1.7的濃度效應曲線。Hill常數方程的表達式如下：

y=fmax-（fmax- fmin）/（1+（x/IC50）n）

在該方程中，y代表歸一化的電流值，x代表多肽毒素的濃度；fmax和 fmin分別代表Nav1.7對多肽毒素的最大與最小反應率，本研究中fmin設置為0；n為Hill常數。

1.3.2 穩態激活與失活曲線分析

通過Boltzmann方程擬合得出多肽毒素處理前后的Nav1.7的電壓依賴性穩態激活與失活曲線。Boltzmann方程表達式如下：

y = 1/ {1 + exp［（V - V50）/ κ］}

在該方程中，y為歸一化的電導值或電流值；V50在穩態激活曲線中代表半激活電位，在穩態失活曲線中代表半失活電位；κ代表曲線的斜率因子。

2 結果與分析

2.1 APTX-1的分離純化與篩選

本試驗采用電刺激法采集溝紋硬皮地蛛毒液。毒液為橙色黏稠液體，有特殊香味，易溶于水。使用分析型RP-HPLC對毒液進行分離純化，共獲得48個組分（圖1a）。對各分離組分進行冷凍干燥。在全細胞膜片鉗模式下檢測各分離組分對表達于HEK293T細胞的Nav1.7電流的抑制活性，篩選到一個抑制活性最強的組分（圖1a中*標記組分）。通過對該組分進行MALDI-TOF-MS質譜分析，得到其分子質量為7 815.2 Da（圖1b）。該組分的質譜結果顯示僅含1個信號峰，由此可以確定分離的組分為單一組分，純度較高。

2.2 APTX-1的N端序列測定

根據鑒定到的分子質量大小，我們推測，該多肽可能含有70余個氨基酸殘基。對其進行Edman降解法測序后，得到其N端前十位氨基酸序列為ASCKQVGEEC（圖2）。根據得到的氨基酸序列進行BLAST搜索，結果未匹配到已報道的毒素序列，表明該多肽為一條新型序列特征的多肽毒素。根據國際多肽毒素的標準系統命名法［16］，我們將其命名為β-ApTx-Cs1，簡稱APTX-1。由于Edman測序的局限性，APTX-1全長序列尚未得出，后續將進行蜘蛛毒腺轉錄組和cDNA文庫的構建，期望從基因水平獲取該多肽毒素的全長序列。

2.3 APTX-1對Nav1.7的親和力

APTX-1是一個新型的Nav1.7多肽抑制劑，我們對APTX-1抑制Nav1.7的親和力進行了研究。利用全細胞膜片鉗技術測定不同濃度的APTX-1對Nav1.7電流的抑制率，發現1.00 μmol/L APTX-1可以完全抑制Nav1.7電流（圖3a）；利用Hill常數方程對不同毒素濃度作用下Nav1.7電流的抑制率進行擬合，繪制APTX-1抑制Nav1.7的濃效曲線（圖3b），測定出APTX-1對 Nav1.7的半數抑制濃度為（0.46±0.08） μmol/L。

2.4 APTX-1對Nav1.7電壓依賴性的影響

已報道的絕大多數蜘蛛毒素主要與VGSCs的電壓敏感結構域結合，并改變VGSCs激活與失活的電壓依賴性，被稱為“門控調制型毒素”［17-19］。本研究選用接近半數抑制濃度的0.40 μmol/L毒素溶液進行下一步研究。利用全細胞膜片鉗技術，記錄并分析APTX-1處理前后Nav1.7的各電壓下代表性電流曲線（圖4a）、電流-電壓曲線（圖4b）、電壓依賴性穩態激活曲線（圖4c）和穩態失活曲線（圖4d）。如圖4a所示：加入0.40 μmol/L APTX-1后，各電壓下的Nav1.7電流均被APTX-1所抑制；加入APTX-1前后，通道的起始激活電壓、峰電流激活電壓以及翻轉電位并沒有發生顯著變化（圖4b）。這些結果表明，APTX-1顯著抑制Nav1.7電流，但不改變Nav1.7的電壓依賴性，同時也不影響Nav1.7的離子選擇性。此外，如圖4c和圖4d所示，Nav1.7在APTX-1處理后的半激活與半失活電壓分別為-25.4 mV與-66.8 mV，對照組的半激活與半失活電壓分別為-24.3 mV與-65.8 mV。這些結果表明，APTX-1也不改變Nav1.7激活與失活的電壓依賴性。

3 討論

本研究通過對溝紋硬皮地蛛毒液進行分離純化、質譜鑒定、蛋白質測序以及Nav1.7活性篩選和作用的門控特性研究，發現了一個對Nav1.7具有抑制活性的新型多肽毒素APTX-1。其對Nav1.7的半數抑制濃度約為（0.46±0.08）μmol/L，且對Nav1.7的穩態激活、失活和電壓依賴性無明顯影響，與之前報道的海南捕鳥蛛毒素HNTX-III和虎紋捕鳥蛛毒素HWTX-IV對Nav1.7的作用特征類似［20-22］。但APTX-1是通過抑制電壓敏感元件還是堵塞孔道區抑制Nav1.7電流，需要進一步通過對作用位點進行分析來確定。深入分析APTX-1與Nav1.7相互作用的分子機制，也可為基于結構與功能研究設計靶向Nav1.7的抑制劑提供基礎。

有毒動物多肽毒素是有毒動物在億萬年生存競爭中進化的產物，具有高度的分子多樣性和活性多樣性。以蜘蛛為例，目前仍未發現在不同的蜘蛛物種中存在完全相同的多肽毒素；此外，蜘蛛多肽毒素對多種離子通道，如電壓門控鈉、鉀、鈣和瞬時感受器陽離子通道等具有調控作用，甚至有些多肽具有強的抗菌和抗腫瘤活性。因此，蜘蛛等有毒動物多肽毒素不僅是其自身捕食與防御的分子武器，同時也能為我們所用，可作為分子工具研究離子通道等的生理病理功能，以及作為新型藥物研發的先導分子。換言之，蜘蛛等有毒動物的毒液是豐富的資源寶庫。我們從溝紋硬皮地蛛毒液中新發現的Nav1.7抑制劑APTX-1具有新的氨基酸序列，也暗示其可能區別于已報道的Nav1.7抑制劑，具有新穎的三維結構。Nav1.7主要表達在外周傷害性感受神經元中，在疼痛信號通路上扮演重要角色，被認為是最具潛力的鎮痛靶點。藥理學研究表明，抑制Nav1.7電流可顯著抑制傷害感受神經元的動作電位爆發，在多種疼痛動物模型中具有良好的鎮痛效果。因此，我們新發現的Nav1.7抑制劑APTX-1具有開發為靶向Nav1.7以治療疼痛新藥物的潛力。

參考文獻（References）：

［1］ DIB-HAJJ S D， YANG Y， BLACK J A， et al. The Na（V）1.7 sodium channel： from molecule to man ［J］. Nature Reviews Neuroscience， 2013， 14（1）： 49-62.

［2］ DE LERA RUIZ M， KRAUS R L. Voltage-gated sodium channels： structure， function， pharmacology， and clinical indications ［J］. Journal of Medicinal Chemistry， 2015， 58（18）： 7093-7118.

［3］ 劉慧麗， 李萍， 李民. 電壓門控性鈉離子通道Nav1.7與疼痛的研究進展［J］. 基礎醫學與臨床， 2012， 32（12）： 1484-1487.

LIU Huili， LI Ping， LI Min. Research progress of voltage-gated sodium channel Nav1.7 and pain ［J］. Basic Medicine & Clinic， 2012， 32（12）： 1484-1487.

［4］ COX J J， REIMANN F， NICHOLAS A K， et al. An SCN9A channelopathy causes congenital inability to experience pain ［J］. Nature， 2006， 444（7121）： 894-898.

［5］ ESTACION M， DIB-HAJJ S D， BENKE P J， et al. Nav1.7 gain-of-function mutations as a continuum： A1632E displays physiological changes associated with erythromelalgia and paroxysmal extreme pain disorder mutations and produces symptoms of both disorders ［J］. The Journal of Neuroscience： the Official Journal of the Society for Neuroscience， 2008， 28（43）： 11079-11088.

［6］ GINGRAS J， SMITH S， MATSON D J， et al. Global Nav1.7 knockout mice recapitulate the phenotype of human congenital indifference to pain ［J］. PLoS One， 2014， 9（9）： e105895.

［7］ GOLDBERG Y P， MACFARLANE J， MACDONALD M L， et al. Loss-of-function mutations in the Nav1.7 gene underlie congenital indifference to pain in multiple human populations ［J］. Clinical Genetics， 2007， 71（4）： 311-319.

［8］ SUTER M R， BHUIYAN Z A， LAEDERMANN C J， et al. p.L1612P， a novel voltage-gated sodium channel Nav1.7 mutation inducing a cold sensitive paroxysmal extreme pain disorder ［J］. Anesthesiology， 2015， 122（2）： 414-423.

［9］ YANG Y， HUANG J， MIS M A， et al. Nav1.7-A1632G mutation from a family withinherited erythromelalgia： enhanced firing of dorsal root ganglia neurons evoked by thermal stimuli ［J］. The Journal of Neuroscience： the Official Journal of the Society for Neuroscience， 2016， 36（28）： 7511-7522.

［10］ YANG Y， WANG Y， LI S， et al. Mutations in SCN9A， encoding a sodium channel alpha subunit， in patients with primary erythermalgia ［J］. Journal of Medical Genetics， 2004， 41（3）： 171-174.

［11］ LANGENEGGER N， NENTWIG W， KUHN-NENTWIG L. Spider venom： components， modes of action， and novel strategies in transcriptomic and proteomic analyses ［J］. Toxins， 2019， 11（10）： 611.

［12］ DONGOL Y， CARDOSO F C， LEWIS R J. Spider knottin pharmacology at voltage-gated sodium channels and their potential to modulate pain pathways ［J］. Toxins， 2019， 11（11）： 626.

［13］ WU T， WANG M， WU W， et al. Spider venom peptides as potential drug candidates due to their anticancer and antinociceptive activities ［J］. The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases， 2019， 25： e146318.

［14］ CATTERALL W A， CEST?LE S， YAROV-YAROVOY V， et al. Voltage-gated ion channels and gating modifier toxins ［J］. Toxicon： Official Journal of the International Society on Toxinology， 2007， 49（2）： 124-141.

［15］ LIANG S. An overview of peptide toxins from the venom of the Chinese bird spider Selenocosmia huwena Wang ［=Ornithoctonus huwena（Wang）］ ［J］. Toxicon： Official Journal of the International Society on Toxinology， 2004， 43（5）： 575-585.

［16］ KING G F， GENTZ M C， ESCOUBAS P， et al. A rational nomenclature for naming peptide toxins from spiders and other venomous animals ［J］. Toxicon： Official Journal of the International Society on Toxinology， 2008， 52（2）： 264-276.

［17］ ZHANG Y， TACHTSIDIS G， SCHOB C， et al. KCND2 variants associated with global developmental delay differentially impair Kv4.2 channel gating ［J］. Human Molecular Genetics， 2021， 30（23）： 2300-2314.

［18］ CHOW C Y， CRISTOFORI-ARMSTRONG B， UNDHEIM E A， et al. Three peptide modulators of the human voltage-gated sodium channel 1.7， an important analgesic target， from the venom of an Australian Tarantula ［J］. Toxins， 2015， 7（7）： 2494-2513.

［19］ CARDOSO F C， DEKAN Z， ROSENGREN K J， et al. Identification and characterization of ProTx-III ［μ-TRTX-Tp1a］， a new voltage-gated sodium channel inhibitor from venom of the tarantula Thrixopelma pruriens ［J］. Molecular Pharmacology， 2015， 88（2）： 291-303.

［20］ REVELL J D， LUND P E， LINLEY J E， et al. Potency optimization of Huwentoxin-IV on hNav1.7： a neurotoxin TTX-S sodium-channel antagonist from the venom of the Chinese bird-eating spider Selenocosmia huwena ［J］. Peptides， 2013， 44： 40-46.

［21］ XIAO Y， BINGHAM J P， ZHU W， et al. Tarantula huwentoxin-IV inhibits neuronal sodium channels by binding to receptor site 4 and trapping the domain ii voltage sensor in the closed configuration ［J］. The Journal of Biological Chemistry， 2008， 283（40）： 27300-27313.

［22］ LIU Z， CAI T， ZHU Q， et al. Structure and function of hainantoxin-III， a selective antagonist of neuronal tetrodotoxin-sensitive voltage-gated sodium channels isolated from the Chinese bird spider Ornithoctonus hainana ［J］. The Journal of Biological Chemistry， 2013， 288（28）： 20392-20403.

收稿日期：2022-12-07；修回日期：2022-12-23。

基金項目：國家自然科學基金項目（31800655）；國家級大學生創新創業訓練計劃支持項目（S202110542020）。

作者簡介：＃為并列第一作者。羅森，碩士研究生；楊坤，本科生。

* 通信作者：陳敏芝，實驗師，主要從事多肽毒素結構與功能研究以及藥物研發。E-mail： chenmz@hunnu.edu.cn。