湖南省不同品種公豬精液品質(zhì)及運(yùn)動(dòng)性能的研究

劉海林，朱立軍，張翠永，陽(yáng)享元，肖斌華，陳方志，李瑾林，朱建軍

1.湖南光大牧業(yè)科技有限公司，長(zhǎng)沙 410131；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)沙 410131；3.湖南省綏寧縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南綏寧 422600；4.湖南省寧鄉(xiāng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南寧鄉(xiāng) 410600

俗話說(shuō)：“母豬好，好一窩；公豬好，好一坡”，這形象地體現(xiàn)了公豬在整個(gè)豬場(chǎng)中的地位和價(jià)值。公豬精液品質(zhì)是人工授精中最重要的因素之一，直接影響母豬受胎率和產(chǎn)仔率等[1]，故每次采精稀釋后要進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，為精液稀釋、保存和利用等提供依據(jù)。本試驗(yàn)從影響受精力相關(guān)程度較大的指標(biāo)，如精子活力、精子畸形率以及精子運(yùn)動(dòng)軌跡等參數(shù)來(lái)分析不同品種的豬精液品質(zhì)，為豬場(chǎng)的精液檢測(cè)和公豬飼養(yǎng)管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)源于湖南省32 個(gè)生豬良補(bǔ)縣的公豬站，在2021 年4 月—2022 年11 月，共采集51 批次247頭成年公豬（長(zhǎng)白豬73頭、大白豬75頭、杜洛克豬99 頭）的鮮精。每個(gè)公豬站提供3～5 頭不同品種（長(zhǎng)白、大白和杜洛克）公豬精液稀釋后的產(chǎn)品，每頭2 份，裝入17 ℃恒溫保存箱，嚴(yán)格按照運(yùn)輸要求送至湖南光大牧業(yè)科技有限公司精液檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 檢測(cè)設(shè)備

精子質(zhì)量分析系統(tǒng)（AndroVision Minitube/德國(guó)）、相差顯微鏡（蔡司）、電子天平、恒溫保存箱、恒溫水浴鍋、恒溫預(yù)熱板、血球計(jì)數(shù)板、載玻片、蓋玻片和移液槍等。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1）精液體積：用電子天平稱量精液質(zhì)量，按照1 g:1 mL的比例換算成精液體積。

2）精子活力和運(yùn)動(dòng)軌跡參數(shù)。采用精子質(zhì)量分析系統(tǒng)（CASA）測(cè)定精子活力和運(yùn)動(dòng)軌跡參數(shù)。先將17 ℃精液樣品輕輕搖動(dòng)均勻，用移液器分別吸取3 個(gè)液層中的精液各10 μL 置于載玻片上并加蓋玻片，在37 ℃條件下預(yù)熱1～2 min，用CASA獲取視野中的精子活力和運(yùn)動(dòng)軌跡參數(shù)，取平均值。其他精子運(yùn)動(dòng)軌跡參數(shù)的計(jì)算方式與精子活力相同。

精子活力計(jì)算公式如下：

M=(n1+n2+n3)/3

式中：M為活力，單位為%；n1，n2，n3為3 個(gè)液層中的活力值。

3）精子密度。采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定精子密度。①制樣：吸取3.95 mL 3.0%氯化鈉溶液于5 mL EP 管中，取50 μL 待測(cè)精液樣品與3.95 mL 3.0%氯化鈉溶液充分混合均勻，制成試樣。②點(diǎn)樣：用蓋玻片將血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室蓋好。吸取10 μL試樣置于血球計(jì)數(shù)板一端計(jì)數(shù)室的邊緣，讓試樣自行流入，使其充滿計(jì)數(shù)室，計(jì)數(shù)室內(nèi)不應(yīng)有氣泡。用同樣方法在血球計(jì)數(shù)板另一端計(jì)數(shù)室點(diǎn)樣后，靜置約5 min。③觀察：將點(diǎn)好樣品的血球計(jì)數(shù)板置于載物臺(tái)上，在100 倍的條件下觀察。④計(jì)數(shù)：采用邊觀察、邊計(jì)數(shù)的方法，用計(jì)數(shù)器清點(diǎn)計(jì)數(shù)室的精子個(gè)數(shù)。每個(gè)計(jì)數(shù)室觀察5 個(gè)中方格，5 個(gè)中方格分別為計(jì)數(shù)室的左上角、右上角、正中間、左下角和右下角。精子計(jì)數(shù)均以精子頭部所處的位置為準(zhǔn)，每個(gè)中方格內(nèi)的精子均為計(jì)數(shù)范圍，方格壓線的精子計(jì)數(shù)遵循“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”的原則。分別記錄2 個(gè)計(jì)數(shù)室5 個(gè)中方格的總精子數(shù)，并取其平均值，記為Ti。

精子密度計(jì)算公式：

D=Ti×80×5×104

式中：D為精子密度，單位為個(gè)/mL；Ti為2 個(gè)計(jì)數(shù)室中5個(gè)中方格總精子數(shù)的平均值，單位為個(gè)；80為精液稀釋倍數(shù)；5 為5 個(gè)中方格精子數(shù)轉(zhuǎn)換成25個(gè)中方格的倍數(shù)；104為25 個(gè)中方格中精液體積為0.1 mm3轉(zhuǎn)換成1 mL的倍數(shù)。計(jì)算結(jié)果保留至小數(shù)點(diǎn)后2位，若2個(gè)計(jì)數(shù)室中5個(gè)中方格總精子數(shù)之間的絕對(duì)差值大于5個(gè)，則應(yīng)重檢。

4）精子畸形率。精子畸形率采用姬姆薩染色法（即仲裁法）。①吸取10 μL 樣品滴于載玻片一端，用另一邊緣光滑的載玻片與有樣品的載玻片呈約35°夾角，先浸潤(rùn)與樣品接觸的邊緣向另一側(cè)緩慢推動(dòng)，將樣品均勻地涂抹在載玻片上，自然風(fēng)干（約 5 min），每個(gè)樣品制作2 個(gè)抹片；②將風(fēng)干后的抹片浸沒(méi)于放有姬姆薩染液的染缸中，染色15～30 min 后用水沖去染液，晾干制成染片，待檢；③將染片置于400倍下觀察，觀察順序?yàn)閺淖蟮接摇纳系较隆８鶕?jù)觀察到的精子形態(tài)，按表1 要求判定正常精子和畸形精子，且一邊觀察，一邊用計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，累計(jì)觀察約200 個(gè)精子，分別記錄精子總數(shù)和畸形精子總數(shù)，拍照保存該樣品的圖片。

表1 精子形態(tài)判定

精子畸形率計(jì)算公式：

式中：Ai為畸形率，單位為%；A0為觀察精子總數(shù)，單位為個(gè)；A為觀察畸形精子總數(shù)，單位為個(gè)。計(jì)算結(jié)果保留至小數(shù)點(diǎn)后1 位，用2 個(gè)平行樣的平均值表述樣品檢測(cè)結(jié)果。若2個(gè)平行樣計(jì)算結(jié)果之間的絕對(duì)差值大于6.0%，則應(yīng)重檢。

5）有效精子數(shù)。有效精子數(shù)（個(gè)/劑）＝精液體積（mL）×精子密度（個(gè)/mL）×精子活力（%）×（1－精子畸形率）（%）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Excel 2021 處理，分析采用SPSS 18.0軟件，檢測(cè)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種公豬間的常規(guī)精液品質(zhì)比較

由表2可知，不同品種公豬間的精子活力有一定的差異，但差異不顯著，順序?yàn)榇蟀棕i＞長(zhǎng)白豬＞杜洛克豬；不同品種間的畸形率和劑量均無(wú)明顯差異；每劑中長(zhǎng)白豬的前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)要高于杜洛克豬和大白豬。

表2 不同品種公豬間的常規(guī)精液品質(zhì)

2.2 不同品種公豬間的精子運(yùn)動(dòng)性能比較

由表3可知，不同品種公豬的精液中，長(zhǎng)白豬精子的緩慢比例顯著高于杜洛克豬和大白豬，長(zhǎng)白豬精子的直線加速比例低于杜洛克豬和大白豬，差異不顯著；長(zhǎng)白豬精子的局部比例高于杜洛克豬和大白豬，差異不顯著；長(zhǎng)白豬精子的轉(zhuǎn)圈比例顯著低于杜洛克豬和大白豬；長(zhǎng)白豬的不動(dòng)比例低于杜洛克豬和大白豬，差異不顯著。

表3 不同品種公豬間的精子運(yùn)動(dòng)性能比較

3 討論

近年來(lái)，隨著生豬人工受精技術(shù)的日趨成熟和生豬養(yǎng)殖技術(shù)的提升，對(duì)精液品質(zhì)的要求也相應(yīng)提高，國(guó)家也更新了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)：《豬常溫精液》GB 23238—2021 和《豬常溫精液生產(chǎn)與保存技術(shù)規(guī)范》GB/T 25172—2020。這些標(biāo)準(zhǔn)涉及到公豬精液采集、稀釋、保存以及成品的質(zhì)量要求等細(xì)節(jié)。GB 23238—2021 中明確規(guī)定公豬精液經(jīng)稀釋后的成品質(zhì)量要求為：劑量≥80 mL，精子活力≥60%，精子畸形率≤20%，前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)≥18×108個(gè)（受體為引入品種或培育品種，常規(guī)輸精）。按照GB 23238—2021 的要求，本研究檢測(cè)了湖南省杜、長(zhǎng)、大3 個(gè)引入品種公豬精液質(zhì)量中的常規(guī)指標(biāo)，結(jié)果表明，不同品種公豬精液的活力和畸形率均無(wú)顯著差異。

畸形精子通常是指形態(tài)和結(jié)構(gòu)異常的精子，分為頭部畸形、頸部畸形、中段畸形和主段畸形等，其產(chǎn)生原因分為原發(fā)性、繼發(fā)性畸形以及三級(jí)異常3種情況。一般優(yōu)良品質(zhì)的公豬精液中畸形率不超過(guò)14%～18%；如果精子畸形率超過(guò)20%（GB 23238—2021），則會(huì)影響精子的受精能力，必須廢棄[2-3]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，部分公豬精液在保質(zhì)期內(nèi)的精子畸形率偏高（接近20%）。通常情況下，隨時(shí)間推移，精子畸形率會(huì)繼續(xù)提高；在人工受精時(shí)，這部分公豬精液的品質(zhì)達(dá)不到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，從而導(dǎo)致母豬無(wú)法受孕。本研究發(fā)現(xiàn)，精子畸形主要表現(xiàn)為尾部的遠(yuǎn)端原生質(zhì)滴數(shù)量偏多，其次為折尾和斷尾。原生質(zhì)滴是精子成熟過(guò)程中原生質(zhì)的殘留物，精子在成熟移行過(guò)程中原生質(zhì)滴從精子頸部移動(dòng)至中部，射出的精液中成熟精子已脫掉原生質(zhì)滴。尾部遠(yuǎn)端原生質(zhì)滴的發(fā)生為繼發(fā)性異常，通常出現(xiàn)在附睪尾中；精子的卷尾和斷尾為三級(jí)異常。這些畸形的發(fā)生可能是在精液處理過(guò)程中，精子受擠壓等因素的刺激而形成。有研究[2-4]表明，一些原發(fā)性因素引起的精子畸形對(duì)受胎率的影響弱于繼發(fā)性和三級(jí)異常。

精子質(zhì)量分析系統(tǒng)（CASA）是1 種對(duì)顯微攝像的計(jì)算機(jī)運(yùn)動(dòng)圖像進(jìn)行自動(dòng)分析的技術(shù)，可快速客觀測(cè)定精子密度、活率和形態(tài)等指標(biāo)，還能提供一系列精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的量化數(shù)據(jù)。精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)是精子運(yùn)動(dòng)能力的體現(xiàn)，可以直接反映精子質(zhì)量；精子遷移率高，意味著精子通過(guò)雌性生殖道到達(dá)受精部位的時(shí)間相對(duì)而言要快。有研究認(rèn)為，精子運(yùn)動(dòng)能力與受胎率具有一定的相關(guān)性[5]。在本試驗(yàn)中，長(zhǎng)白豬精子的緩慢比例顯著高于杜洛克豬和大白豬，同時(shí)長(zhǎng)白豬精子的直線加速比例低于杜洛克豬和大白豬，但差異不顯著，這說(shuō)明長(zhǎng)白豬精子的遷移速率低于杜洛克豬和大白豬。長(zhǎng)白豬精子的轉(zhuǎn)圈比例顯著低于杜洛克豬和大白豬，同時(shí)長(zhǎng)白豬精子的不動(dòng)比例低于杜洛克豬和大白豬，但差異不顯著，這表明長(zhǎng)白豬的前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)的比例高于杜洛克豬和大白豬，這與表2 中每劑長(zhǎng)白豬的前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)高于杜洛克豬和大白豬的結(jié)果一致。

在實(shí)踐生產(chǎn)中，公豬的遺傳基因、營(yíng)養(yǎng)與管理、年齡與采精頻率到精液采集、稀釋、保存和運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)均能影響精液品質(zhì)。因此，建議從以下幾個(gè)方面進(jìn)行改進(jìn)：①品種方面，引進(jìn)有系譜檔案的合格公豬；選留時(shí)及時(shí)剔除有遺傳缺陷的血統(tǒng)，并淘汰性能差的老齡公豬（4歲以上）和無(wú)法正常采精的公豬。②營(yíng)養(yǎng)與管理方面，保證豬舍環(huán)境溫度（17～25 ℃）和充足的運(yùn)動(dòng)場(chǎng)所；合理調(diào)節(jié)公豬體膘，保證公豬體況健康；保持5 d/次的采精頻率。③人員管理方面，對(duì)相關(guān)人員進(jìn)行有效的培訓(xùn)、溝通和監(jiān)管，以確保采精、稀釋、保存以及運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)落實(shí)到位，從而提高每批次精液合格率[1,6-8]。