飼料中大豆異黃酮檢測方法的建立

何繼紅，李蘭，楊江勇

1.中牧（北京）動物營養科技有限公司，北京 100070；2.中國農科院農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081；3.成都蓓樂康生物技術有限公司，成都 610000

大豆異黃酮（soy isoflavones，SI）是豆科植物的次生代謝產物，為黃酮類物質，其母核為3-苯并吡喃酮，主要包括大豆苷、大豆黃苷、染料木苷及其相應苷元。其結構類似于雌激素，具有雙向雌激素作用，即類雌激素作用和抗雌激素作用。大豆異黃酮可增強動物免疫力、提高繁殖性能，促進動物生長，其作為飼料添加劑有劑量小、見效較快等特點，具有廣闊應用前景[1-3]。但是由于其抗雌激素作用，臨床上使用時應注意飼料組成、添加時機、添加劑量和持續時間，避免不良反應的發生。因此，有必要建立高效快捷的檢測方法，為大豆異黃酮在畜牧業的合理使用提供支持。目前，尚未見飼料大豆提取物中6種物質的檢測方法。本研究旨在建立高效液相色譜方法（HPLC），用于檢測飼料中的大豆異黃酮，該方法可同時測定大豆苷、大豆苷元、大豆黃苷、染料木苷、大豆黃素和染料木素的含量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1）標準品：大豆苷、大豆苷元（大豆黃酮）、大豆黃苷，染料木苷、大豆黃素，染料木素等標準品，均購自中科質標所。

2）高效液相色譜儀帶二極管矩陣檢測器。島津；色譜柱C18，長250 mm，內徑4.6 mm，粒度5 μm。

3）5%純度的大豆異黃酮，由成都蓓樂康生物技術有限公司饋贈。

4）分析天平。梅特勒公司。

1.2 試驗方法

1）標準溶液制備。精密稱取大豆苷、大豆苷元、大豆黃苷、染料木苷、大豆黃素、染料木素對照品適量，置于容量瓶中，加甲醇（AR）溶液超聲溶解5 min，制成每1 mL 溶液含0.1 mg/mL 過0.45 μm 微孔濾膜過濾。

2）樣品前處理方法。精密稱取大豆異黃酮提取物20 mg 置于50 mL 容量瓶中，加入甲醇（AR）溶液超聲溶解5 min，冷卻至常溫，定容至50 mL，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜過濾。

3）流動相制備。以乙腈與0.1%醋酸水為流動相，取乙腈與0.1%醋酸水過0.45 μm 微孔濾膜，超聲脫氣20 min后，冷卻至室溫備用。

4）色譜條件。色譜柱C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；波長：260 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；溶劑：乙腈與0.1% 醋酸水梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

5）測定。取提取溶液10 μL 注入液相色譜中，記錄各個峰的峰面積，然后按外標法進行計算。

6）標準曲線的繪制。精密稱量大豆異黃酮標準品適量，使其質量濃度介于0.2～20.0 μg/mL，取5個濃度值。各取10 μL 進樣，HPLC 檢測。每一濃度進樣3次，取平均值。以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，求出回歸曲線和相關系數。

7）檢測限和定量限的測定。取10個空白樣品，按“1.2”中2）方法處理，測得基線噪音值，按信噪比為3～10計算方法檢測限和定量限。

8）添加回收率。分別以質量濃度2、15 μg/mL測定添加回收率，按“1.2”中2）方法檢測5%純度的大豆異黃酮。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

取上述濃度配制的大豆異黃酮標準溶液，在選定的色譜條件下進行測定，色譜峰面積和濃度呈線性相關，各組分標準曲線見表2，標準色譜圖見圖2。由表2 可知，建立的HPLC 方法，R2介于0.992～0.999，線性范圍良好。從圖1 可以看出，6 種物質均可分離，從而佐證建立的大豆異黃酮HPLC 方法可進行檢測分析。

圖1 大豆異黃酮標準色譜圖

表2 大豆異黃酮各組分的標準曲線

2.2 檢測限和定量限

根據空白樣品的基線噪音值，求其平均值，以大約3 倍信噪比計算檢測限，以大約10 倍信噪比計算定量限，經計算所得檢測限和定量限見表3。大豆異黃酮各組分的定量限介于0.197 0～0.238 5 μg/mL。飼料中大豆異黃酮的添加量范圍一般為30～200 mg/kg，本方法的定量限可滿足檢測需求。

表3 大豆異黃酮各組分的檢測限和定量限 μg/mL

2.3 添加回收率的測定

分別以2、15 μg/mL 的質量濃度進行添加回收試驗，檢測結果見表4。由表4 可知，添加回收率介于97.45%～102.54%。

表4 添加回收試驗結果

2.4 5%純度大豆異黃酮的檢測

按建立的HPLC 方法檢測5%純度的大豆異黃酮，可檢測6 種組分的含量分別為：大豆苷1.13%、大豆黃苷0.22%、染料木苷2.79%、大豆苷元0.55%、大豆黃素0.06%和染料木素0.29%，總黃酮含量為5.04%。

3 討論

大豆黃酮具有調節激素水平、促進生殖系統發育、提高泌乳能力、提高免疫力、強化骨骼等多重作用，在豬和蛋禽飼養方面，可提升動物的生產性能指標，獲得增值效益。盧建等[1]研究結果發現，在如皋黃蛋雞日糧中添加50、100、200 mg/kg 的大豆黃酮，可以提高受精蛋孵化率和入孵蛋孵化率。邵丹等[2]研究發現，30、60 mg/kg 大豆黃酮可顯著提升產蛋后期海蘭褐蛋種雞的產蛋率和產蛋量。肖蘊祺等[3]研究表明，大豆黃酮組的產蛋率提高了11.67%（P＜0.05），料蛋比降低了8.1%（P＜0.05），大豆黃酮組的哈氏單位提高了7.7%（P＜0.05）。張玲等[4]研究表明，飼糧中添加30 g/t大豆異黃酮，可提高烏骨雞11.67%的產蛋率，降低8.1%的料蛋比，在產蛋后期添加大豆異黃酮，可改善蛋雞生產性能和蛋品質。上述研究表明，添加不同濃度的大豆異黃酮，對畜禽的生產性能影響不一，原因在于大豆異黃酮的雙向雌激素作用。

由于SI中含有多個組分，因而其方法一般為多組分分析方法。胡莉等[5]2017 年建立的HPLC 方法，可測定糧食中6 種大豆異黃酮（大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素）。楊子秋等[6]2018 年建立了HPLC 法測定保健食品中4種大豆異黃酮的含量：大豆苷、大豆素、染料木苷、染料木素的平均回收率分別為101.61%、100.11%、101.95%、101.21%。馬翛然等[7]2018 年建立了可同時測定大豆和大豆制品中黃豆黃素、黃豆黃苷、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、鳶尾黃酮苷和鷹嘴豆芽素A 共8 種異黃酮含量的HPLC 方法。本方法以甲醇水溶液提取異黃酮，經C18 固相萃取柱凈化，梯度洗脫，加標回收率為79.3%～102.5%。吳俊發等[8]2021 年建立超高效液相色譜法（UPLC）同時測定保健品中大豆苷、染料木苷、染料木素和大豆素4種大豆異黃酮的分析方法。

上述研究，均采用HPLC反向色譜技術，檢測波長介于250～260 nm，采用梯度洗脫程序。提取溶液多選擇80%～90%甲醇水溶液，但是楊子秋等[6]研究表明80%的甲醇水溶液提取效果最差，究其原因可能為樣品來源不同。色譜技術對不同基質的樣品有不同的提取凈化要求，如果基質簡單，可直接使用有機溶劑進行處理，但是基質復雜或者組分含量偏低，就需要采用相適應的凈化富集技術，如馬翛然等[7]研究中有發酵類產品，故采取了C18 固相萃取技術。飼料中的基質相對簡單，本研究中，雖然大豆提取物中6 種組分的含量不一，但可以直接采用甲醇進行提取，結合文獻資料，本研究建立了可檢測飼料中大豆異黃酮含量的HPLC 方法，方法的檢測限可達0.2 μg/mL，可用于檢測飼料中大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、大豆黃素和染料木素等6種組分。