高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)枳實(shí)及枳殼藥材中12 種黃酮苷類成分*

曾 輝，黃玉蘭，稅丕容，呂 謙

（四川省瀘州市市場(chǎng)檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川瀘州 646000）

中藥枳實(shí)為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL. 及其栽培變種或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果，具有破氣消積、化痰散痞之效，用于積滯內(nèi)停、痞滿脹痛、瀉痢后重、大便不通、痰滯氣阻、胸痹、結(jié)胸、臟器下垂等證的治療；中藥枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL. 及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)，具有理氣寬中、行滯消脹之效，用于胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內(nèi)停、臟器下垂等證的治療［1］。枳實(shí)、枳殼藥材主要含黃酮苷類［2］、生物堿類［3］、揮發(fā)油類［2，4］、香豆素類［2，5］、檸檬苦素類［2］等成分，且含多種微量元素［6］、酚酸類化合物及β-谷甾醇［7］等。黃酮苷類活性成分對(duì)心腦缺血損傷、肝損傷、心律失常有改善作用，還具有鎮(zhèn)痛、抗自由基和抗腫瘤等作用［8-12］。目前，大量文獻(xiàn)對(duì)枳實(shí)、枳殼藥材所含活性成分種類、分離提取工藝和定性定量檢測(cè)等方面進(jìn)行了報(bào)道［13-16］。但現(xiàn)有測(cè)定方法均較復(fù)雜，本研究中建立了高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)檢測(cè)枳實(shí)、枳殼藥材中12種黃酮苷類成分含量，旨在簡(jiǎn)化檢測(cè)方法，提高操作效率，為2 種藥材的深入開發(fā)與利用提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC - 2030C 3D Plus 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；1260 型高效液相色譜儀（安捷倫科技＜ 中國＞ 有限公司）；XS205 型電子分析天平（德國Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；MJ - 300 型超聲清洗器（無錫市美極超聲設(shè)備有限公司）；ULUP - TEZ型超純水儀（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.2 試藥

橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)為110721 - 202220，含量97.2%），新橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)為111857-201804，含量99.4%），川陳皮素（批號(hào)為112055 - 202102，含量99.7%），均購自中國食品藥品檢定研究院；枸橘苷對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)為M25HB179212，含量99.2%）；圣草次苷對(duì)照品（批號(hào)為PCS - 220714，含量98.13%），新北美圣草苷對(duì)照品（批號(hào)為22051001，含量98.33%），蕓香柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)為PCS - 210309，含量98.60%），柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)為PCS - 210913，含量98.89%），柚皮素對(duì)照品（批號(hào)為PCS - 210224，含量99.21%），橙皮素對(duì)照品（批號(hào)為PCS-200811，含量98.45%），橙皮內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)為PCS - 220718，含量98.05%），橘紅素對(duì)照品（批號(hào)為PCS - 210123，含量98.78%），均購自北京中科質(zhì)檢生物有限公司；乙腈為色譜純，甲酸、甲醇均為分析純，水為純化水。枳實(shí)藥材樣品27 批、枳殼藥材樣品15 批，均經(jīng)四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院黎躍成主任藥師鑒定為蕓香科植物酸橙及其栽培變種的幼果或未成熟果實(shí)。藥材信息見表1（S為枳實(shí)、Q 為枳殼，以S27及Q15為對(duì)照藥材；中檢院即中國食品藥品檢定研究院）。

表1 藥材樣品信息Tab.1 Information of medicinal samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液- 乙腈，梯度洗脫（0～25 min 時(shí)18%B，25～65 min 時(shí)62%B，65～81 min時(shí)18%B）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：284 nm（圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素）、330 nm（橙皮內(nèi)酯、川陳皮素、橘紅素）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：依次取12 種對(duì)照品（按2.1 項(xiàng)中順序）9.50，8.80，10.36，15.29，10.42，10.35，10.18，5.09，5.41，4.88，10.56，5.57 mg，置10 mL 容量瓶中，加甲醇制成單一對(duì)照品溶液。各取適量，置同一20 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取枳實(shí)藥材樣品粉末0.05 g 和枳殼藥材樣品粉末0.1 g（均過4號(hào)篩），精密稱定，置20 mL容量瓶中，加甲醇適量，室溫下超聲（功率600 W、頻率50 kHz）處理30 min，用甲醇定容，經(jīng)0.45μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得枳實(shí)及枳殼藥材樣品溶液，分別記為供試品溶液Ⅰ、Ⅱ。

陰性對(duì)照品溶液：以甲醇作為陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性與專屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，供試品溶液（Ⅰ、Ⅱ），陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果理論板數(shù)按柚皮苷峰計(jì)應(yīng)不低于3 000；分離度均大于1.5，基線分離良好；陰性對(duì)照無干擾，表明專屬性良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Eriocitrin 2.Neoeriocitrin 3.Narirutin 4.Naringin 5.Hesperidin 6.Neohesperidin 7.Poncirin 8.Naringenin 9.Hesperetin 10.Meranzin 11.Nobiletin 12.TangeretinA1，A2.Mixed reference solution B1，B2.Test solution Ⅰ C1，C2.Test solution Ⅱ D1，D2.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2項(xiàng)下單一對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，制成系列對(duì)照品溶液。精密量取10 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系及檢測(cè)限、定量限考察結(jié)果Tab.2 Results of the linear relation test，LOD and LOQ investigation

檢測(cè)限與定量限考察：分別精密量取2.2項(xiàng)下單一對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，并按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比（S/N）為3︰1、10︰1 時(shí)的質(zhì)量濃度分別作為檢測(cè)限、定量限。結(jié)果見表2。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果藥材樣品中12 種成分峰面積的RSD，枳實(shí)依次為0.68%，0.69%，1.03%，1.22%，1.38%，0.60%，0.30%，0.32%，0.22%，0.16%，0.29%，0.18%（n= 6），枳殼依次為0.68%，0.69%，1.03%，1.22%，1.38%，0.60%，0.30%，0.32%，0.22%，0.16%，0.29%，0.18%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，4，8，12，16，24 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果藥材樣品中12種成分峰面積的RSD，枳實(shí)依次為1.10%，1.40%，0.31%，1.96%，1.52%，1.43%，0.74%，0.83%，0.92%，1.01%，1.74%，0.59%（n= 6），枳殼依次為1.57%，0.96%，0.24%，0.26%，0.50%，0.34%，1.17%，1.23%，1.30%，1.38%，0.34%，1.69%（n=6），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：分別稱取枳實(shí)、枳殼藥材樣品適量，各6 份，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果藥材樣品中12 種成分峰面積的RSD，枳實(shí)依次為0.95%，1.68%，1.99%，0.98%，0.40%，0.23%，1.59%，1.62%，1.76%，1.81%，1.40%，1.25%（n= 6），枳殼依次為1.04%，0.96%，0.83%，0.77%，1.27%，0.70%，1.39%，1.61%，0.16%，1.78%，1.58%，0.78%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：分別取枳實(shí)、枳殼藥材樣品適量，各6份，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在不同實(shí)驗(yàn)室內(nèi)以不同儀器，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果藥材樣品中12 種成分峰面積2 次結(jié)果的比值，枳實(shí)依次為100.20%，100.21%，101.04%，100.20%，100.20%，100.20%，100.21%，100.22%，100.22%，100.22%，100.22%，100.20%（n=6），枳殼依次為99.79%，100.13%，99.93%，99.83%，100.01%，99.70%， 99.64%， 99.89%， 99.83%， 100.12%，99.38%，99.49%（n=6），表明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的枳實(shí)、枳殼藥材樣品適量，各9 份，分別加入一定質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（%，n=9）Tab.3 Results of the recovery test（%，n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取42 批藥材樣品各適量，分別按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄峰面積，并計(jì)算藥材樣品含量，結(jié)果見表4。

表4 藥材樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.4 Results of content determination of 12 flavonoid glycosides in medicinal samples（mg/g，n=3）

3 討論

預(yù)試驗(yàn)中，比較了不同品牌的色譜柱，最終選擇分離效果較好的Agilent Zorbax SB-C18柱；選擇流動(dòng)相時(shí)比較了甲醇、乙腈分別與甲酸、磷酸組合，結(jié)果乙腈洗脫效果較好、甲酸的pH 更適合；洗脫方法比較了勻速梯度和等度，前者減少了梯度段，方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定；進(jìn)行紫外吸收光譜掃描時(shí)，分取2個(gè)測(cè)定點(diǎn)，除橙皮內(nèi)酯、川陳皮素和橘紅素選取330 nm外其余成分均選用284 nm為吸收波長。

對(duì)比粉碎至不同粗細(xì)程度的枳實(shí)、枳殼藥材發(fā)現(xiàn)，藥材樣品越細(xì)提取越完全，但越細(xì)粉碎越困難，綜合條件后選取過4號(hào)篩的粉末。觀察了提取溶劑甲醇、乙醇、乙酸乙酯及提取溶劑的體積分?jǐn)?shù)，考慮到要盡可能提取完12種黃酮苷類成分，選取了純甲醇作提取溶劑；對(duì)比超聲與回流提取方式及提取時(shí)間15，30，45，60 min，發(fā)現(xiàn)超聲30 min 時(shí)，方法簡(jiǎn)便且基本能提取完全；對(duì)比超聲時(shí)的溫度（低于室溫、室溫、高于室溫及60 ℃）的提取效果，發(fā)現(xiàn)室溫的提取效率高且適用于高溫易分解的成分。預(yù)試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，樣品中加入50 mL 甲醇可保證提取效率，采用適當(dāng)?shù)姆椒饪s供試品溶液可保證含量較少的成分能被定量測(cè)定。

由藥材樣品含量測(cè)定結(jié)果可見，整體上枳實(shí)藥材中各成分含量高于枳殼藥材；枳實(shí)、枳殼藥材中含量較多的成分為柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷，然后為川陳皮素、蕓香柚皮苷、新北美圣草苷和枸橘苷；且藥材樣品中可能無橙皮內(nèi)酯，橘紅素的含量可能低于定量限，但能被檢出；個(gè)別藥材樣品中圣草次苷含量可能低于定量限，但具有偶然性。

綜上所述，所建立的方法簡(jiǎn)便、可靠，可用于同時(shí)檢測(cè)枳實(shí)、枳殼藥材中12種黃酮苷類成分。