益生菌聯合飲食干預對妊娠期糖尿病糖脂代謝及妊娠結局的影響*

秦智娟,馬宗麗△,鄒美林,朱曉琴,劉 姝,王曉梅

(如皋市人民醫院:1.婦產科;2.病理科,江蘇南通 226500)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是妊娠期最易發生的并發癥之一,可導致母嬰近、遠期代謝性疾病的發生風險明顯增加[1]。多項研究已證實,機體局部和系統性胰島素抵抗(insulin resistance,IR)增加是GDM發生的核心[2-3]。胎盤是妊娠期重要的胰島素靶器官,也是孕期母兒各種分子交換的重要場所。胰島素受體底物1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)/磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)通路是目前已知的最重要的胰島素信號轉導通路[4]。研究表明,多重因素可導致胰島素的分泌增加,IRS-1/PI3K/PKB信號通路被激活,提高了葡萄糖轉運蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)的活性,并加快GLUT4由囊泡膜易位至細胞膜的轉運速度,而GLUT4負責胎盤絨毛中的葡萄糖代謝[5],其下游信號分子囊泡相關蛋白23(synaptosome-associated protein of 23 kDa,SNAP23)可促使GLUT4的囊泡與質膜融合,進一步加快葡萄糖的轉運速度,增加胰島素的敏感性[6-7]。孕期腸道菌群失調可導致腸壁通透性增加,產生多種炎癥因子,破壞胰島素在組織細胞中的轉運[8-9]。本研究基于上述理論基礎,擬探索益生菌聯合飲食干預對GDM外周血糖脂代謝指標及胎盤組織中胰島素信號轉導通路IRS-1/GLUT4/SNAP23相關蛋白的表達變化,以評價益生菌對GDM孕婦的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年12月至2022年12月規范產檢且計劃在本院分娩的孕婦83例,均于孕24～28周產檢時行口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test,OGTT)及實驗室血液學指標檢測。納入標準:(1)診斷符合2014年我國GDM診治指南標準[10],即滿足OGTT檢測服糖前血糖≥5.1 mmol/L、服糖后1 h血糖≥10.0 mmol/L、服糖后2 h血糖≥8.5 mmol/L中任意一項;(2)既往體健;(3)孕期無其他妊娠合并癥及內外科合并癥,且孕期未使用降糖藥物治療。排除標準:(1)糖尿病合并妊娠者;(2)GDM需使用降糖藥者;(3)入組前1個月內使用過抗生素者;(4)入組前2周內服用含益生菌的酸奶或其他發酵食品者;(5)合并急慢性肝腎功能損害、心功能不全、炎癥性腸病、惡性腫瘤者;(6)存在傳染性疾病者。采取隨機數字表法將納入的GDM孕婦分為單純飲食干預組(對照組,40例)與益生菌聯合飲食干預組(益生菌組,43例)。本研究經醫院倫理委員會批準(倫理編號:KY20210304),詳盡告知研究對象本研究的意義、目的,患者簽署知情同意書,自愿參加本研究。

1.2 主要試劑及儀器

免疫組織化學染色試劑盒、兔抗人IRS-1多克隆抗體(批號:17509)、鼠抗人GLUT4單克隆抗體(批號:66846)、兔抗人SNAP23多克隆抗體(批號:10825)均購自武漢三鷹生物技術有限公司;通用二抗PV6000、DAB顯色液購自北京中杉金橋生物技術有限公司;RM2245石蠟切片機購自德國Leica公司;光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1門診干預方案

所有入組孕婦均接受研究者制訂的飲食控制指導方案(由門診醫生提供GDM每周食譜推薦表),量化每周食譜及食量,并每周選擇3 d拍照記錄食物,密切追蹤飲食至分娩日。剔除隨訪期間不配合飲食方案,使用益生菌酸奶或其他發酵食品及抗生素者。益生菌組于孕28周后加用益生菌,每天早餐后30 min服用2粒益生菌制劑(雙歧桿菌三聯活菌腸溶膠囊,晉城海斯制藥有限公司,國藥準字S19993065),連續服用8周后行相關外周血清學指標復測,益生菌組繼續口服益生菌至臨分娩前停服。所有入組孕婦每2周在產前門診進行1次標準的產前檢查,并每周進行電話隨訪。

1.3.2外周血糖脂代謝指標檢測

于益生菌干預前及干預8周后測定以下外周血清學指標:(1)糖代謝指標包括空腹血糖(FBG)、餐后2 h血糖(2 h PG)、空腹胰島素(FINS)、胰島素抵抗指數(HOMA-IR)、胰島β細胞功能指數(HOMA-β)及糖化血紅蛋白(HbA1c);(2)脂代謝指標包括血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C);(3)炎癥指標C反應蛋白(CRP)。以上指標均為本院常規開展的檢測項目。采用穩態模式評估法(HOMA)評價IR情況及胰島β細胞功能[11]:

HOMA-IR=FINS×FBG/22.5

(1)

HOMA-β=20×FINS/(FBG-3.5)

(2)

1.3.3胎盤組織標本采集

胎盤娩出后5 min內取胎盤靠近臍帶根部直徑1.0～1.5 cm范圍內的母體面組織,避開大血管及鈣化點,滅菌生理鹽水反復沖洗后濾紙吸收水分,分離出1 cm3組織,在10%甲醛溶液中室溫固定24 h,備用。

1.3.4蘇木素-伊紅(HE)染色胎盤組織病理學觀察

取分離組織,經脫水、石蠟包埋、切片后行HE染色,觀察胎盤組織學改變,同時計數胎盤絨毛成熟不良、干絨毛小動脈增厚、絨毛間質毛細血管充盈3項指標情況[12]。

1.3.5免疫組織化學檢測IRS-1/GLUT4/SNAP23相關蛋白表達

根據免疫組織化學染色試劑盒說明書操作。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照,已知陽性切片為陽性對照,細胞內抗原表達的部位出現棕黃色顆粒判定著色陽性。分別由兩位病理科醫生采用雙盲法在光學顯微鏡下觀察胎盤組織的細胞染色情況。根據著色強度分為4個級別:不著色(0分)、淺黃色(1分)、棕黃色(2分)、棕褐色(3分);對 5個視野進行觀察,估計著色區域面積,<5%,5%～25%,>25%～50%,>50～75%,>75%分別記為0,1,2,3,4分;每個視野的計分為二項計分相乘,所得平均值為最后的評分,陰性表達為0～4分,陽性表達為>4分。免疫反應評分(immunoreactive score,IRS)=陽性細胞百分比×染色強度評分。IRS結果判定:陰性(-)評0～3分,弱陽性/低表達(+) 評4～6分,中度陽性/中表達(++)評7～9分,強陽性/高表達(+++)評10～12分[13]。

1.3.6妊娠不良結局

記錄兩組巨大兒、胎兒窘迫、新生兒低血糖、產后出血、產褥感染及新生兒高膽紅素血癥等妊娠不良結局發生情況并比較。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組一般資料比較

兩組間年齡、孕周和干預前、后BMI比較,差異均無統計學意義(P>0．05),且兩組內干預前后BMI均無明顯差異(P>0.05),見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組干預前后外周血糖代謝指標比較

干預前,除HOMA-β外,兩組其余各項糖代謝指標均無明顯差異(P>0.05)。與干預前比較,對照組干預8周后FBG、2 h PG水平及HOMA-β無明顯變化(P>0.05),FINS、HbA1c水平及HOMA-IR明顯升高(P<0.05);益生菌組干預8周后2 h PG、HbA1c水平及HOMA-β無明顯變化(P>0.05),FBG、FINS水平及HOMA-IR明顯下降(P<0.05);且干預8周后,益生菌組FBG、FINS、HbA1c水平及HOMA-IR明顯低于對照組,HOMA-β明顯高于對照組(P<0.05),兩組2 h PG水平無明顯差異(P>0.05),見表2。

表2 兩組干預前后外周血糖代謝指標比較

2.3 兩組干預前后外周血脂代謝指標及CRP比較

干預前,兩組TG、TC、LDL-C、CRP水平無明顯差異(P>0.05),HDL-C水平有明顯差異(P<0.05)。與干預前比較,對照組干預8周后TG、TC、LDL-C、CRP水平明顯升高(P<0.05),HDL-C水平明顯下降(P<0.05);益生菌組干預8周后TG、LDL-C水平明顯下降(P<0.05),HDL-C水平明顯上升(P<0.05);且干預8周后,益生菌組HDL-C水平明顯高于對照組(P<0.05),LDL-C水平明顯低于對照組(P<0.05),兩組TG、TC、CRP水平無明顯差異(P>0.05),見表3。

表3 兩組干預前后外周血脂代謝指標及CRP比較

2.4 GDM胎盤組織的病理學觀察

足月的正常胎盤組織可見成熟絨毛,血管壁光滑,血管內皮細胞扁平。而GDM產婦胎盤絨毛發育不成熟,滋養葉細胞增生,基底膜增厚,干絨毛小動脈管壁增厚,絨毛間質毛細血管呈充盈狀態,見圖1。對兩組胎盤病理學改變進行量化分析,結果顯示:兩組絨毛成熟不良、干絨毛小動脈增厚、絨毛間質毛細血管發生率均無明顯差異(P>0.05),見表4。

A:對照組GDM胎盤組織;B:益生菌組GDM胎盤組織。

表4 兩組胎盤組織病理學改變比較[n(%)]

2.5 兩組胎盤組織IRS-1、GLUT4及SNAP23表達情況

免疫組織化學結果顯示,GDM胎盤中IRS-1染色主要見于胎盤滋養細胞的細胞質上,GLUT4、SNAP23主要染色于滋養細胞的細胞質及細胞膜上,見圖2;益生菌組IRS-1、GLUT4及SNAP23陽性表達率均高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),見表5。IRS分析顯示:與對照組比較,益生菌組IRS-1、GLUT4、SNAP23表達水平均明顯升高(P<0.05),見表6。

表5 兩組胎盤組織IRS-1、GLUT4及SNAP23的陽性表達率比較[n(%)]

表6 兩組胎盤組織IRS-1、GLUT4及SNAP23的IRS結果比較(n)

2.6 兩組妊娠不良結局發生率比較

對照組新生兒低血糖、新生兒高膽紅素血癥發生率均明顯高于益生菌組(P<0.05),兩組巨大兒、胎兒窘迫、產后出血、產褥感染的發生率均無明顯差異(P>0.05),見表7。

表7 兩組妊娠不良結局發生率比較[n(%)]

3 討 論

KOREN等[14]于2012年采用第二代測序技術研究了妊娠期婦女腸道菌群的變化情況,觀察到妊娠晚期孕婦腸道中菌群的α多樣性降低、β多樣性增高,同時發現了腸道菌群的紊亂與IR、體重增加、免疫炎癥密切相關[15-16]。由此開啟了腸道菌群在GDM防治方向的研究,近年來研究發現腸道菌群影響GDM的可能機制有:(1)GDM孕婦腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌數量下降,腸桿菌、腸球菌等菌落數增加,可導致分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)減少,腸道通透性增加,脂多糖通過腸壁血管進入血循環[17],激活Toll樣受體4介導的炎癥免疫通路,從而刺激一系列炎癥因子,如白細胞介素(interleukin,IL)-6、IL-2、IL-17、腫瘤壞死因子-α、CRP等分泌增加,加重胰島β細胞功能紊亂[18];(2)厚壁菌、擬桿菌、疣微菌、毛螺菌等菌群的豐度發生改變,影響了包括瘦素、視黃醇結合蛋白4、脂聯素等脂肪因子的代謝[19-20],胰島素受體底物IRS絲氨酸磷酸化被干擾,胰島素信號轉導通路受阻,產生IR;(3)GDM孕婦孕期可產生短鏈脂肪酸的腸道菌群數量下降,使腸道激素如胰高血糖素樣肽-1的釋放減少,胰島素分泌減少[21]。目前,腸道菌群在妊娠期糖脂代謝領域的研究及臨床應用仍處于起步階段,益生菌的合理及優化應用或可成為GDM 患者血糖管理的新靶點。

由于研究條件的局限性,本研究尚存在以下不足之處:(1)樣本量偏小;(2)干預時間較短,由于益生菌在腸道黏膜的定植需要一定的時間,可考慮提前干預時機或延長干預時間;(3)觀察指標局限,對益生菌在GDM中所產生的影響評估不夠全面;(4)研究對象的地域差別、飲食習慣、營養狀況等也可能對腸道菌群的分布種類產生影響[27]。未來將進一步完善研究,并在菌株水平上確定GDM發生、發展中的特定腸道菌群,制訂個體化的益生菌干預方案,為GDM的防治提供依據。