血漿SPINK4表達在結直腸腺癌和進展期腺瘤中的診斷價值*

周龍妹,李 萍,尚育煥,王艷玲,尹春英,李 丹,何培元

(承德醫學院附屬醫院消化內科,河北承德 067000)

結直腸腺癌(colorectal cancer,CRC)患者約占全球所有新發癌癥病例的10%,健康人群患CRC的風險為4%～5%[1],是癌癥相關死亡的常見原因之一。結直腸癌不僅侵及中老年人群,很多青少年也深受其害[2]。近年來,篩查CRC的方法有結腸鏡、糞便隱血試驗(FOBT)[3]、CT掃描[4]、糞便免疫化學物表達水平[5-6]、腫瘤標記物[甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖類抗原(CA199)][7]表達水平等,但都有其局限性,難以準確進行早期診斷和大規模篩查。因此,尋找一種針對CRC靈敏度高、特異度強的篩查方法是目前該領域關注的重點。絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal-type 4(SPINK4)又稱PEC60,最初從豬腸道[8]中分離得到,主要表達于胃腸道和免疫系統[9]。作為一種蛋白酶抑制劑,SPINK4被認為參與了對黏膜和上皮組織蛋白降解的防御。SPINK家族有多個成員,目前已經明確包括SPINK1～SPINK12[10]。近年來,越來越多的文獻報道相關成員的作用及其機制,其中SPINK1、SPINK2、SPINK5、SPINK6、SPINK7、SPINK8 被發現與腫瘤的發生、發展存在密切的聯系。但是很少有人報道SPINK4與CRC、進展期腺瘤(advanced adenoma,AA)之間的關系。本研究旨在分析血漿SPINK4表達與CRC和AA患者診斷的相關性,以期為臨床診治提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020年6月至2021年12月在本院就診并經結腸鏡及病理檢查確診為CRC的患者62例,其中男29例,女33例,年齡(61.90±11.38)歲;突變型p53陰性者20例,突變型p53陽性者42例。經結腸鏡及病理檢查確診為AA的患者15例,其中男8例,女7例,年齡(61.13±9.46)歲。納入標準:(1)經結腸鏡及病理檢查確診為CRC或AA;(2)首次確診;(3)年齡30～80歲。排除標準:(1)合并膽囊炎;(2)合并其他惡性腫瘤;(3)資料不全。選擇同期來院體檢的健康志愿者22例為HC組,其中男8例,女14例,年齡(51.50±8.04)歲。腫瘤分期按照2016年國際抗癌聯盟(UICC)|美國癌癥聯合委員會(AJCC)TNM分期標準(第八版)進行TMN分期。 本研究經醫院倫理委員會批準(2021013),患者及家屬已簽署知情同意書。

1.2 方法

研究對象空腹采集多管前臂靜脈血5 mL,標本在抽血后2 h內進行以下操作:4 ℃下以3 484 r/min離心10 min,吸取上清液至EP管,-80 ℃保存備用,ELISA試劑盒(上海語純生物有限公司)檢測血漿SPINK4表達;其余標本30 min內送檢,電化學發光法檢測CEA表達(經過校正CEA≥5 μg/L為陽性),全自動化學發光免疫分析儀(cobas 8000 e801)購自北京凱捷有限公司。將獲得的CRC組織標本立即置于10%甲醇中固定,進行免疫組織化學檢測。操作步驟如下:恒溫烤片機烤片,脫蠟;乙醇梯度脫水,乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復,依次孵育一抗和二抗,DAB顯色,蘇木素染色,封片。

免疫組織化學檢測結果判定:每張切片選擇染色良好的區域,連續觀察5個高倍鏡(10×) 視野,每個視野內細胞數>50 個。細胞核或細胞質出現棕黃色或黃褐色顆粒為p53表達陽性。根據細胞染色深淺評分:未顯色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,黃褐色為3分;按顯色細胞的比例評分:無著色細胞或著色細胞≤10%為0分,>10%～25%為1分,>25%～50%為2分,>50%～75%為3分,>75%為4分。二者乘積數0 分為陰性(-),1～4分為弱陽性(+),5～8分為陽性(++),9～12分為強陽性(+++) 。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組血漿SPINK4及CEA表達比較

CRC組及AA組血漿SPINK4表達均低于HC組(Z=3.72、-0.41,P<0.05),CRC組CEA表達高于HC組(Z=-3.63,P<0.05),見表1。

表1 不同人群血漿SPINK4及CEA表達比較[M(Q1,Q3),μg/L]

2.2 SPINK4、CEA單獨及聯合診斷CRC及AA的臨床價值

SPINK4聯合CEA診斷CRC及AA的曲線下面積(AUC)、靈敏度、特異度均高于SPINK4、CEA單獨診斷,見表2。

表2 SPINK4、CEA單獨及聯合診斷CRC及AA的臨床應用價值

在診斷CRC時,SPINK4聯合CEA的準確度及陰性預測值均高于單獨檢測;在診斷AA時,SPINK4聯合CEA的準確度及陽性預測值均高于單獨檢測,見表3。

表3 SPINK4、CEA單獨及聯合診斷CRC及AA的準確度、陽性預測值、陰性預測值

2.3 CRC患者不同臨床病理特征血漿SPINK4表達比較

有淋巴結轉移CRC患者SPINK4表達低于無淋巴結轉移者,Ⅲ、Ⅳ期血漿SPINK4表達低于Ⅰ、Ⅱ期,差異有統計學意義(P<0.05),見表4。

表4 CRC患者不同臨床病理特征血漿SPINK4表達比較[M(Q1,Q3),μg/L]

2.4 CRC患者不同臨床病理特征與血漿SPINK4表達的相關性分析

CRC患者血漿SPINK4表達與淋巴結轉移呈負相關(r=-0.528,P<0.05)。

2.5 p53在CRC組織中表達情況

SPINK4、CEA單獨診斷CRC的截斷值分別為1.09 μg/L、2.57 μg/L,根據截斷值將SPINK4、CEA分為高表達組及低表達組,見圖1。SPINK4低表達組和CEA高表達組中突變型p53陽性表達率明顯增加(P<0.05),見表5、圖2。

A:CEA;B:SPINK4。

A:SPINK4低表達;B:SPINK4高表達;C:CEA高表達;D:CEA低表達。

表5 突變型p53在CRC組織中的表達情況

3 討 論

2020年CRC成為全球第三大常見惡性腫瘤,同時也是惡性腫瘤死亡的第二大原因[11]。50～74歲的中老年人群成為全球CRC新發病例主要人群[12-14],且>50歲人群在全球早發性CRC中的發病率仍呈上升趨勢[15-17]。大部分CRC患者在早期無明顯臨床癥狀,確診時已經出現了淋巴結或遠處轉移[18],而發生遠處轉移的CRC患者5年生存率僅為12%,如何在早期對CRC患者有效地進行篩查是目前亟待解決的問題。大多數CRC是由腺瘤經過一段漫長的時間發展而來,一般需要10～20年。有研究表明,非AA發展成CRC 的年轉化率約為1.2%,而AA發展為CRC的年轉化率是前者的2～3倍[19]。AA是指滿足以下1項及以上標準的腺瘤:直徑>10 mm,含有絨毛成分,有重度異型增生或高級別上皮內瘤變[20]。因此及時發現并切除AA是降低CRC發病率的有效措施。目前結腸鏡是診斷CRC和AA 的“金”標準,因為其不但可發現病變,還能在鏡下直接活檢完善病理學檢查。但是由于我國人口基數大,結腸鏡設備及內鏡醫師的數量有限,很難對50歲以上及有結直腸癌家族史的40歲以上人群做大規模篩查。因此找到一種能篩出最需要接受結腸鏡檢查的高危患者的方法極為重要。

近年的研究發現,SPINK4與CRC的發生、發展有關。WANG等[21]研究發現結直腸癌腫瘤標本中SPINK4表達降低,并與較差的生存率相關,這與本課題組前期的研究結果相同。本研究顯示,CRC組及AA組血漿SPINK4表達明顯低于HC組,CRC患者SPINK4表達與淋巴結轉移呈負相關,說明其在CRC中具有抑癌作用,并且抑制癌細胞的轉移,SPINK4表達降低可能與CRC患者的不良預后及較差的治療效果有關。SPINK4聯合CEA診斷CRC及AA的AUC、準確度均高于SPINK4、CEA單獨診斷,表明二者聯合診斷具有較高的臨床價值。既往研究發現,腫瘤標記物CEA、CA199、CA242、CA724對CRC診斷的特異度和靈敏度分別為66.39%、48.29%,62.18%、35.01%,66.37%、39.98%,59.41%、25.06%[22]。本研究結果表明,血漿SPINK4聯合CEA診斷CRC的靈敏度和特異度分別為90%、68%,均優于以往的腫瘤標記物。p53 是正常細胞增殖的重要調控因子,野生型p53基因是一種抑癌基因,能夠修復損傷的DNA,促進癌細胞凋亡[23];但突變型p53基因是一種癌基因,抑制細胞凋亡,促進癌細胞增殖[24]。本研究免疫組織化學檢測結果顯示,CRC患者SPINK4低表達組及CEA高表達組突變型p53陽性表達率明顯增加(P<0.05)。SUPPIAH等[25]證明突變型p53 預示著惡性程度較高的CRC,并且伴隨著較差的預后,這進一步說明低表達SPINK4和高表達CEA及突變型p53均促進了CRC的發生。

本研究雖然表明血漿SPINK4表達在CRC和AA中具有一定的臨床診斷價值,但仍有一定的局限性。(1)樣本量較小,結果的可靠性仍需進一步驗證;(2)未分析SPINK4表達與生活習慣、方式的關系,有研究表明吸煙[26]、過量飲酒[27]、超重或肥胖[28]、腸道菌群失調[29]、大量食用紅肉和加工肉類[30]都可能影響CRC的發生,在后續的研究中作者也會加入相關因素進行探討;(3)由于CRC組患者尚未達到生存訪問時間,從而無法得知預后情況。在后續研究中,將進一步擴大樣本量,分析SPINK4如何影響結直腸細胞的增殖、侵襲和遷移,尋找靶點,以期更加準確地對CRC及AA患者進行靶向治療。