東亞地區新生隱球菌菌種復合體種群的遺傳多樣性特征及其意義

劉益婷 張健烽 王美懿 張宇 陳敏

(1.天津中醫藥大學研究生院,天津 301600;2.天津市中醫藥研究院附屬醫院皮膚科,天津 300131;3.上海長征醫院皮膚科,上海市醫學真菌分子生物學重點實驗室,上海 200003)

新生隱球菌菌種復合體(Cryptococcusneoformansspecies complex,CNSC)是一種重要的致病性擔子酵母,是隱球菌感染中最常見的致病菌種[1-2],全世界每年新發隱球菌病有超過80%由其感染所致。既往研究發現,分離自中國等東亞地區的新生隱球菌菌種復合體種群以ST5/VNI型菌株為主,且遺傳多樣性極低,累及的患者有相當比例免疫功能正常,這種流行病學及群體遺傳學特征在全球都是獨特的。新生隱球菌菌種復合體主要存在于土壤、桉樹等樹木以及鳥類糞便中,尤其是鴿糞,與鳥類遷徙有著密切的聯系[3]。其主要感染途徑為包含孢子或小莢膜菌體的氣溶膠被人體吸入,再穿越肺血屏障進入人體循環系統,尤其以肺-淋巴復合體的形式潛伏在人體,在人體免疫功能低下的時候增殖引起播散感染,當穿過宿主血腦屏障引起播散傳染,可發展成隱球菌性腦膜腦炎、腦脊髓膜炎等[4]。

近年來,各種新型分子標記技術的研發應用推動了新生隱球菌菌種復合體的進化和群體遺傳學研究[5]。二十世紀八十年代開始,利用免疫學方法根據新生隱球菌菌種復合體的多糖莢膜組成的不同,將新生隱球菌菌種復合體分為A血清型、D型血清菌株及其雜合子 AD 血清型菌株;其中A血清型菌株在全球優勢分布(>80%),而D血清型菌株則在歐洲地區分布率較高[1, 6];在我國等東亞地區,A血清型菌株也是最主要的致病菌株[3,7-12]。自1990年代起,基因組 DNA 限制性片段長度多態性分析 (restriction fragment length polymorphism, RFLP)、PCR指紋圖譜 (PCR fingerprinting)、擴增性片段長度多態性分析 (amplified fragment length polymorphism, AFLP)、多位點序列分析 (multi-locus sequence type, MLST)、全基因組序列分型 (whole genome sequence typing, WGST) 等先后應用于新生隱球菌菌種復合體的分子流行病學及群體遺傳學研究,極大地提高了人類在該研究領域的認識水平[13-15]。目前,以噬菌體核心序列M13為單引物的 PCR 指紋圖譜技術,可以將全球的 A 血清型菌株劃分為 VNI 型、VNII 型和 VNB 型三個分型[16];國際人與動物真菌學學會 (International Society for Human and Animal Mycology, ISHAM) 推薦的MLST技術,可以將VNI 型菌株劃分為 ST4、 ST5、ST6、ST31、ST93 等數百種序列(sequence type,ST) 型菌株[17],這也是目前在新生隱球菌菌種復合體分子分型研究中應用最為廣泛的技術路線,但基于全基因組序列的WGST分型技術是該研究領域的發展方向。詳見圖1。

圖1 新型分子標記技術推動隱球菌菌種復合體的分類學及群體遺傳學的研究Fig.1 Novel molecular marker techniques have advanced the taxonomy and population genetics of Cryptococcus species complex

ST5/VNI型菌株廣泛分布于全世界,但其在東亞地區占比極高(>95%)[12,18-23],且不同于全球大多數其他國家,東亞地區的新生隱球菌菌種復合體感染病例中的HIV陰性和免疫功能正常的宿主占比較高[19,24-27],這種特征在全世界都是獨特的。因此,系統回顧我國等東亞國家和地區的新生隱球菌菌種復合體的臨床與環境分離菌株種群的遺傳多樣性特征、播散路徑、耐藥趨勢等研究結果,對分離自東亞地區新生隱球菌菌種復合體種群的基因型及交配型分布、群體擴張特征等多個群體遺傳學角度進行綜述,為提高揭示新生隱球菌菌種復合體感染的精準防治水平在我國等東亞國家進化和種群擴張的模式等群體遺傳學特征的研究提供理論科學基礎。

1 東亞地區新生隱球菌菌種復合體種群的群體遺傳多樣性特征

新生隱球菌菌種復合體在全球范圍內廣泛分布,基于全基因組序列的系統發育學分析提示其起源于非洲[28-29],且不同遺傳譜系的菌株在地理分布、毒力及對抗真菌藥物的敏感性等方面存在顯著差異[30-32]。根據目前已經報道的數據[33],A血清型的ST5/VNI 型菌株(>95%)在東亞地區的分布最占優勢,與其他地區有顯著不同[1,18,21]。例如2013年,有學者對泰國222株臨床分離株進行分析,其中主要以ST4(41.9%;93/222)、ST5(13.5%;30/222)、ST6(37.8%;84/222)為主[19]。2020年,有學者在印度收集296株臨床分離株,以及227株環境分離株;對其中105株(91株臨床和14株環境分離株)進行分析,所有分離菌株分子分型均屬于VNI型;臨床株群體中78%(71/91)屬于ST93型,環境株中29%(4/14)屬于ST93型[34]。分離自中國、日本、韓國等東亞地區的新生隱球菌菌種復合體種群具有相似的遺傳多樣性特征,與分離自其他亞洲國家如泰國(ST4、ST6/VNI)、印度(ST93/VNI)的新生隱球菌菌種復合體種群基因型結果有顯著不同[20,23]。

目前,東亞地區除蒙古國和朝鮮未有新生隱球菌菌種復合體報道外,均有新生隱球菌菌種復合體相關報道,其中以來自中國的報道最多。從2013年至2022年,先后有學者對北京、四川、江西、華東地區等多地進行報道[35-45]。對其統計得出,總共1327株臨床株,90.2%(1197/1327)株臨床株屬于ST5型新生隱球菌菌種復合體,占絕對優勢。日本、韓國也有相應報道,經統計,其臨床株優勢分型菌株也是ST5型,分別占比91.8%(67/73)[19-20]、95.6%(175/183)[12,22]。

例如,2013年有學者對亞洲476份新生隱球菌菌種復合體臨床分離株進行研究(228株來自HIV陽性患者),其中屬于東亞地區的分別來自中國的上海和香港地區以及日本共138株,其中88.4%(122/138)屬于新生隱球菌菌種復合體ST5型[19];2013年,對日本長崎的35株從HIV陰性患者中分離的新生隱球菌菌種復合體進行了分析,91.4%(32/35)為VNI型,3株為VNⅡ型;其中88.6%(31/35)屬于ST5型[20];2014年,對分離自韓國首爾地區的46株新生隱球菌菌種復合體臨床分離株進行分析,均為VNI型,95.7%(44/46)屬于ST5型[12];2015年,對韓國137株新生隱球菌菌種復合體的臨床分離株和10株環境分離株進行分析,臨床分離株中99.3%(136/137)為VNI型,1株為VNⅣ型;VNI型菌株中96%(131/137)屬于ST5;環境分離株中均為VNI型,其中ST5 (n=7),ST31 (n=3)[22];2015年,對北京兩所醫院的新生隱球菌菌種復合體臨床分離株進行分析,27.2%(22/81)來自HIV陽性患者,其中97.5%(79/81)為新生隱球菌菌種復合體 VNI 型,1株VNB型;其中93.8%(76/81)株屬于ST5型,其中ST296、ST295菌株是首次在中國報道[35];2015年,對四川地區的新生隱球菌菌種復合體臨床分離株進行分析,91株新生隱球菌菌種復合體均為VNI 型,對其中18株進行MLST分析,88.9%(16/18)株屬于ST5[36];2016年,對在中國哈爾濱、遼寧、四川等7個地區共收集了303株新生隱球菌菌種復合體臨床分離株,96.4%(292/303)屬于ST5型,6.3%(19/303)屬于ST31型[37];2017年,來自北京地區的新生隱球菌菌種復合體臨床和環境分離株研究發現,25株臨床分離株中96%(24/25)為VNI型,1株為VNⅢ;88%(22/25)屬于ST5型[38];2018年,對江西的86株新生隱球菌菌種復合體臨床分離株進行研究,40.7%(35/86)來自于HIV陽性患者,其中84.9%(73/86)屬于ST5型,以及7種其他ST型,其中ST319和ST226之前未曾發現[39];2020年,對華東地區的97株新生隱球菌菌種復合體臨床分離株進行研究,28.9%(28/97)來自于HIV陽性患者。其中99%(96/97)為VNI型,1株為VNⅣ型;其中92.8%(90/97)屬于ST5型[40];2021年,對北京一醫院從HIV陽性患者中分離出的74株新生隱球菌菌種復合體進行分析,有65株進行分型,分為 12種ST型,其中78.5%(51/65)屬于ST5型[41];2021年,對江西199株新生隱球菌菌種復合體臨床分離株進行分析,37.2%(74/199)來自HIV陽性患者,其中89.4%(178/199)屬于ST5型[42];2021年,對四川 130株新生隱球菌菌種復合體臨床分離株進行了研究,分別為87.7%(114/130)屬于ST5,10%(13/130)屬于ST31[43];2022年,對華東133新生隱球菌菌種復合體臨床分離株進行了研究,45.9%(61/133)來自HIV陽性患者,除了4株未明確分型外,96.2%(128/133)為VNI型,1株為VNⅡ型;其中90.2%(120/133)株為ST5型[44];2022年,對中國臺灣南部的109株新生隱球菌菌種復合體臨床分離株,并對其中90株進行了MLST分析,98.9%(89/90)為VNI型,1株為VNⅡ型,其中82.3%(79/90)屬于ST5型[45]。

綜上,東亞各地區(蒙古與朝鮮未見相關報道)的優勢ST型如下:在中國,臨床株優勢ST型為ST5型,占90.2%;但環境株優勢ST型為ST31型,占47.2%,ST5型僅占12%。韓國臨床株和環境株優勢ST型均為ST5型,分別占95.6%和70%。日本臨床株優勢ST型為ST5型,占91.8%,環境未見報道。

目前學術界普遍認為隱球菌感染的主要途徑是吸入源于環境的含孢子或菌體的氣溶膠[1-2]。然而,2017 年一項來自中國北京及其周邊地區的新生隱球菌菌種復合體環境分離株的研究卻發現 ST5 型菌株在該地區的新生隱球菌菌種復合體環境株種群中占比極低 (約 6.2%;5/86),處于優勢分布地位的是 ST31 型菌株 (占比約 66.7%;54/81)[38]。針對這一反常現象,2021年,筆者等在長三角地區 11 個城市開展新生隱球菌菌種復合體環境分離菌株的遺傳多樣性研究,發現處于優勢分布地位的仍然是 ST31 型菌株 (約 21.3%;13/61),ST5 型菌株占比約 19.7% (12/61),亦遠低于其在臨床株種群中的優勢分布比例[46]。臨床與環境菌株種群的 ST 型分布存在顯著的差異,臨床株種群以ST5 型為主,環境株種群以 ST31 型為主,這提示ST5 型菌株可能較 ST31 型等其他ST型菌株具有更高的毒力。

2 交配型

新生隱球菌菌種復合體(Cryptococcusneoformansspecies complex,CNSC)屬于典型的異宗交配的擔子菌酵母,其在自然環境中主要是單倍體交配型α和交配型a細胞之間的交配。交配型的確定可以通過特異性引物對STE20位點的等位基因進行PCR[12];也可以通過新生隱球菌菌種復合體(血清型A)分別與KN99(a)和 KN99(α)在酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養基(yeast peptone dextrose,YPD)上共培養,或新生隱球菌菌種復合體(血清型D)分別與JEC20 (a) 和JEC21 (α)在YPD上共培養[47]。交配型基因位點(mating type,MAT)是目前已鑒定基因位點中最大的一個,超過100 kb[48]。研究發現,我國等東亞國家的新生隱球菌菌種復合體種群菌株絕大多數都是A血清型的α配型菌株 (占比大于 99%),其毒力也強于 a 配型菌株,且更易擴散到中樞神經系統[1,3,47-48]。既往研究表明,臨床和環境分離出的新生隱球菌菌種復合體菌株絕大多數都是血清型A(MATα)(超過90%以上)和血清型D(MATα),僅僅極少數的菌株屬于AD血清型雜合子菌株,其中血清型AaDα占比相對較多[29,47,49-51]。

3 抗真菌藥物的敏感性

近年來,因為臨床抗真菌藥物的不規范使用以及自然環境中的唑類抗真菌農藥的廣泛使用,新生隱球菌菌種復合體在全球的耐藥率也在不斷上升。2016年,有學者對國內多省的野生型菌株和非野生型菌株分別進行了藥物敏感性測試,發現野生型菌株對常用抗真菌藥物敏感,而非野生型菌株有23株對氟康唑(fluconazole,FLU)的MIC>8 mg/L[37]。2019年,有學者對上海、四川、浙江以及廣東的多株兒童感染患者的新生隱球菌菌種復合體進行藥物敏感性研究,也有多株新生隱球菌菌種復合體分別對5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)、氟康唑和伊曲康唑(itraconazole,ITR)藥物敏感性降低的的報道[52]。近年來,國內有多位學者對新生隱球菌菌種復合體進行藥物的敏感性測試,其MIC整體呈上升趨勢,其中尤以對氟康唑為明顯,詳見圖2。

圖2 近年來,國內新生隱球菌菌種復合體MIC值走向。 #: MIC的幾何平均數;*: GM數值為0,是該條文獻未給出該值; ▲:該行為MIC值范圍Fig.2 In recent years, the MIC value trend of CNSC in China. #: The geometric mean of the MIC; *: The GM value is 0, which is not given in this article; ▲: This line is the MIC value range

4 結 論

總結近10年來全球各地的多項針對隱球菌臨床分離菌株的相關研究結果,我們發現以中國為代表的東亞地區國家隱球菌感染有獨特的分子流行病學特征,如遺傳多樣性程度極低,ST5 型/α 配型新生隱球菌菌種復合體菌株在臨床分離菌株種群中占絕對優勢地位(>95%),其群體擴張模式符合從外界傳入后,快速無性克隆性擴增的模式。但也有研究提示即使在克隆性擴增菌株群體內部,也存在無性交配增殖的模式,值得進一步研究。ST5 型新生隱球菌菌種復合體菌株也起源于非洲,雖然在全球分布,但其在東亞地區隱球菌病感染中占比極高,其可能已經完成對我國等東亞國家本土生態龕位環境壓力的適應性進化,同時使其獲得了較強的毒力及更易侵襲免疫功能正常宿主的能力。此外,由于抗真菌藥物的濫用以及農藥的推廣,新生隱球菌菌種復合體對抗真菌藥物,尤其是唑類藥物的不敏感或耐藥趨勢逐漸明顯。因此,加強對ST5型等新生隱球菌菌種復合體菌株的起源、種群擴增模式、毒力進化、基因流等群體遺傳學及抗真菌藥物的敏感性監測研究對提高我國在內的東亞國家隱球菌病防治水平有重要的科學意義。